[发明专利]酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法

权利要求书

1.酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其特征在于利用核酸适配体与土霉素的特异性结合能力，核酸染料SYBR GREEN I(SGI)的光学性能，以及外切酶对体系的循环放大作用实现对牛奶中土霉素的定量检测，包括以下步骤：建立SGI与双链核酸荧光体系；建立核酸适配体传感器荧光检测方法；测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性；运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素。

2.如权利要求1所述的酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其中建立SGI与双链核酸荧光体系的步骤如下：首先用Tris HCl缓冲溶剂稀释土霉素适配体和相应的互补序列至浓度为10μM，接着在1.5mL的小离心管中加入50μL浓度为10μM的土霉素适配体和50μL浓度为10μM互补序列cDNAs，涡旋振荡均匀后放入水浴锅中，在95℃下加热10min解除自身螺旋；最后待加热后的核酸混合物冷却至室温复性，并用二重蒸馏水稀释100倍；土霉素适配体和其互补序列合成的双链DNA(dsDNA)50nM在4℃冰箱过夜保存以备使用。

3.如权利要求1所述的酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其中建立核酸适配体传感器荧光检测方法的步骤如下：首先将15μL SGI标准工作液加入到100μL制备好的dsDNA(50nM)溶液中，并在室温下涡旋反应7min；接着用二重蒸馏水配制好100μg/mL土霉素储备液，将5、10、15、25、35、45、55μL的土霉素储备液加入混合物中(土霉素终浓度为1、2、3、5、7、9、11μg/mL)，接着加入25U exonuclease I和50μL外切酶10x buffer，TrisHCl缓冲溶剂补齐500μL体系；将混合物放入水浴锅中，在37℃的水温下反应30min；最后在80℃水温下水浴15min停止外切酶反应，在室温下进行荧光光谱扫描；以荧光信号的下降比率(F₀-F)/F₀为纵坐标建立土霉素的标准曲线，其中F和F₀分别为体系中存在与不存在目标物时在525nm处的荧光信号强度；空白对照实验用等量的二重蒸馏水代替土霉素溶液，按照相同步骤检测荧光光谱；结果显示，525nm处荧光峰值差F-F₀与三聚氰胺的浓度之间呈良好的线性关系(R＝0.9964)，经3σ/S(3σ/S，3倍的背景标准偏差除以标准曲线斜率)计算，方法检出限为0.157μg/mL，说明了该荧光传感器可以实现对土霉素简单、灵敏、高效的定性定量检测。

4.如权利要求1所述的酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其中测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性的实验步骤如下：选择实际样品中易出现残留的与土霉素结构相似的抗生素进行了选择性实验，分别为四环素(TET)，强力霉素(DOX)，洛美沙星(LOM)，氧氟沙星(OFLX)；首先，分别配制等浓度土霉素(OTC)，四环素(TET)，强力霉素(DOX)，洛美沙星(LOM)，氧氟沙星(OFLX)的标准溶液；接着等量抗生素溶液分别加入环境条件相同的上述实验体系中，并按照权利要求3中步骤反应；经过相同反应时间后用RF-5301荧光分光光度计检测加入抗生素前后体系的荧光强度，各抗生素在体系中的终浓度为10μg/mL；结果显示只有加入土霉素的体系荧光强度会出现明显的下降，即该基于酶切循环核酸适配体传感器检测土霉素的方法具有较好的选择性。

5.如权利要求1所述的酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其中所述运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素的测定步骤如下：首先，在15mL离心管中依次加入4mL生牛奶，6mL水和2mL的10％三氯乙酸，涡旋混合一分钟除去牛奶中的蛋白质和有机物；之后混合物在20℃下超声15min，然后以13,000rpm的速度离心10分钟用以分离样品；将离心得到的上清液转移到另一个离心管中，在10,000rpm速度下再次离心10min去除沉淀物，按照权利要求3所述的方法，测定上清液中土霉素；结果显示加入土霉素后的荧光猝灭率(F₀-F)/F₀与牛奶中土霉素的浓度之间具有良好的线性关系(R＝0.9906)，说明该荧光传感器在实际样品的背景下，仍然具有良好的检测能力。