[发明专利]酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法

说明书

酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，是利用核酸适配体的特异性识别能力和酶切循环放大策略构建了一种可以快速检测土霉素的核酸适配体荧光传感器；当土霉素不存在时，SGI插入双链结构中，体系得到很高的荧光强度；而当体系中存在土霉素时，目标物会并破坏双链结构，体系荧光强度下降；通过测定加入目标物前后体系荧光强度变化，可以实现对土霉素的定性和定量检测；另外，在体系中加入核酸外切酶Exo I可以形成酶切循环放大的功效；本方法的建立包括以下步骤：建立SGI与双链核酸荧光体系；建立核酸适配体传感器荧光检测方法；测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性；运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素。

技术领域

酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

四环素发现在20世纪中叶，无论是在医学还是在兽药领域都占有十分重要的地位。而土霉素作为四环素类抗生素的一种，同样是十分出色的广谱抗菌抗生素。因此，土霉素经常被添加在牲畜家禽的饲料中，用于预防各种动物传染病和促进生长。四环素类抗生素在低剂量下可以在短时间内通过代谢排出体外，但如果剂量过高就会蓄积在动物体内。若长时间摄入土霉素残留过高的动物源食品会对人体的骨骼和脏器造成损害，如过敏、毒性效应、耐药性等等。因此动物源性食品中的土霉素残留检测一直是监管的重点。

关于土霉素残料的常规检测方法有很多种，其中最主要、常见的是色谱法。包括高效液相色谱法(HPLC)，液相色谱质谱联用法，气相色谱法等等。尽管这些方法有很好的准确性和再现性，但样品处理过程过于繁琐复杂、所需的仪器设备也十分昂贵。另外，酶联免疫分析法(ELISAs)也是检测土霉素的常用方法之一。其原理在于将抗原或抗体固定在固相载体上并与某种酶结合，形成酶标抗原或抗体后与受检测物进行反应，最后通过染色观察目标物在底物中含量。然而，酶联免疫法的背景吸收强，底物和酶需要长时间的反应以及多次清洗步骤、复杂费时，反应容易受到环境的影响和样品基质的干扰。因此，开发一种更加简洁有效、灵敏度高、选择性强的土霉素检测技术十分有必要。适配体一种通过SELEX技术特殊筛选的寡糖核苷酸序列，一般有几十个碱基构成，可以明确识别和结合不同的目标。如金属离子、氨基酸、蛋白质、有机分子、甚至整个细胞。核算适配体有不弱于抗体的生物识别能力。并且合成简单，适配体批次之间有很好的重现性，只要序列已知就可以用化学标记和化学固定随时修改，是一种良好的检测工具。因为这些优点，核酸适配体被广泛应用于食品药品检测领域，以及分子识别探针和生物传感器技术方面的探究。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸适配体传感器与酶切循环放大策略检测土霉素的方法，以快速、简单、灵敏地检测牛奶中土霉素的残留量。

技术问题：酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素基于以下原理：

酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，是利用核酸适配体的特异性识别能力和核酸染色剂SYBR GREEN I(SGI)对于双链DNA的染色特性，构建了一种可以灵敏、快速检测土霉素的核酸适配体荧光传感器；在不存在土霉素的情况下，SGI插入土霉素适配体和其互补序列形成双链结构，能在495nm的激发光下得到很高的荧光强度；而当体系中存在土霉素时，目标物会和适配体特异性结合并将其从双链DNA中剥离开，导致SGI从氢键中释放，体系荧光强度明显降低；通过测定加入目标物前后体系荧光强度变化，可以实现对三聚氰胺的定性和定量检测。

本发明的技术方案：

包括以下步骤：建立SGI与双链核酸荧光体系；基于核酸适配体传感器与酶切放大循环策略检测土霉素的可行性分析；建立核酸适配体传感器荧光检测方法；测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性；运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素。

(1)建立SGI与双链核酸荧光体系