[发明专利]鸭坦布苏病毒病E-ELISA检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.原核表达的鸭坦布苏病毒TA株E蛋白在制备鸭坦布苏病毒病E-ELISA检测试剂盒中的应用，其中所述试剂盒包含标准阳性对照鸭血清、标准阴性对照鸭血清、鸭坦布苏病毒TA株E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鸭酶标二抗及其他试剂，

其中所述标准阳性对照鸭血清为提取自用鸭坦布苏病毒免疫的SPF鸭的血清，所述标准阴性对照鸭血清为提取自SPF鸭的血清，

所述鸭坦布苏病毒TA株E蛋白所包被的ELISA板通过用在原核表达系统中重组表达的鸭坦布苏病毒TA株E蛋白包被ELISA板制得，其中所述鸭坦布苏病毒TA株E蛋白通过将SEQID No.1所示的编码坦布苏病毒TA株E蛋白的核苷酸序列克隆在原核细胞表达载体中并在原核细胞中表达制得，并且

所述羊抗鸭酶标二抗为HRP标记的羊抗鸭二抗，

所述其他试剂包括样品稀释液、10×浓缩洗液、TMB底物显色液和终止液，其中所述10×浓缩洗液为100mmol/L PBST，pH7.4，所述样品稀释液由所述10×浓缩洗液按照1∶9V/V稀释获得，所述终止液为2mol/L硫酸溶液。

2.权利要求1所述的应用，其中所述试剂盒的检测方法包括：

(1)反应步骤：将待测鸭血清样品、标准阳性对照鸭血清和标准阴性对照鸭血清分别加入所述鸭坦布苏病毒TA株E蛋白所包被的ELISA板的独立的孔中，在37℃反应1h；

(2)与二抗反应步骤：将每孔洗涤后，分别加入所述HRP标记的羊抗鸭二抗，在37℃反应1h；

(3)显色步骤：将每孔洗涤后，分别加入TMB底物显色液进行显色反应；

(4)读数步骤：终止显色反应，在酶标仪上在波长450读数；

(5)判断步骤：待测鸭血清样品反应孔的OD值与标准阴性对照鸭血清反应孔的OD值的比例大于等于2.1时，表示待测鸭血清样品为阳性，说明待测鸭感染了鸭坦布苏病毒；上述比值小于2.1时，表示待测鸭血清样品为阴性，说明待测鸭没有感染鸭坦布苏病毒。

3.一种制备权利要求1所述的鸭坦布苏病毒病E-ELISA检测试剂盒的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)原核表达并纯化鸭坦布苏病毒TA株E蛋白，取适量的鸭坦布苏病毒TA株E蛋白包被ELISA板；

其中所述鸭坦布苏病毒TA株E蛋白通过将SEQ ID No.1所示的编码坦布苏病毒TA株E蛋白的核苷酸序列克隆在原核细胞表达载体中并在原核细胞中表达制得；

其中所述的E蛋白包被的ELISA板可以由以下过程制备得到：

用0.05mol/L pH值9.6的碳酸盐缓冲液将已纯化的坦布苏病毒TA株E蛋白稀释为5μg/ml；将含有E蛋白的碳酸盐缓冲液加入到96孔酶标板中，100μl/孔，置于4℃，15～18h；倾尽96孔板中的液体，加入10mmol/LpH值7.4的PBST，200μl/孔，洗3次，每次5min；倾尽96孔板中的液体，加入封闭液，置于37℃2.5h；倾尽96孔板中的液体，加入10mmol/L pH值7.4的PBST，200μl/孔，洗3次，每次5min；彻底倾尽96孔板中的液体，将包被有E蛋白的96孔板置于37℃，干燥2h，放入有干燥剂的塑料袋中；

其中所用的封闭液的配制如下：KH₂PO₄ 0.26g，Na₂HPO₄-12H₂O 2.89g，NaCl 8.71g，脱脂奶粉50g，去离子水800ml，调pH值至7.4，添加去离子水至1L，在此溶液中添加0.5ml Tween-20；

(2)从SPF鸭提取血清作为标准对照阴性血清，从用鸭坦布苏病毒免疫后的SPF鸭提取血清作为标准对照阳性血清；

(3)商购得到HRP羊抗鸭二抗；

(4)配制样品稀释液、10×浓缩洗液、TMB底物显色液和终止液：

样品稀释液：每个试剂盒装量1瓶，250ml/瓶；

10×浓缩洗液的配制过程如下：KH₂PO₄2.6g，Na₂HPO₄-12H₂O 28.9g，NaCl 87.1g，去离子水800ml，调pH值至7.4，添加去离子水至1L，在此溶液中添加5ml Tween-20；

使用时10×浓缩洗液按照1：9V/V稀释获得样品稀释液；

TMB底物显色液购自天根公司，每个试剂盒装量1瓶/盒50ml；

终止液：每个试剂盒装量1瓶，250ml/瓶；终止液的配制：将浓度为18mol/L的浓硫酸与去离子水按1∶9配制制得2mol/L的硫酸溶液作为终止液；

(5)组装：将步骤(1)中得到的鸭坦布苏病毒TA株E蛋白包被的ELISA板与适量的步骤(2)-(4)制得的成分组装成试剂盒。