[发明专利]鸭坦布苏病毒病E-ELISA检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明涉及以一种鸭坦布苏病毒E蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验(E‑ELISA)检测试剂盒、其制备方法及其应用。本发明试剂盒包含标准阳性对照鸭血清、标准阴性对照鸭血清、坦布苏病毒E蛋白(SEQ ID No.2)所包被的ELISA板、羊抗鸭酶标二抗、TMB底物显色液、终止液。本发明制备的E‑ELISA检测试剂盒用于鸭坦布苏病毒感染后的抗体检测。

本申请是2013年7月11日提交的发明名称为“鸭坦布苏病毒病E-ELISA检测试剂盒及其制备方法”的发明专利申请201310290098.4的分案申请。

技术领域

本发明提供一种以鸭坦布苏病毒E蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验(E-ELISA)检测试剂盒，本发明还提供所述试剂盒的制备方法。

背景技术

黄病毒(Flavivirus)是通过节肢动物传播的，属于黄病毒家族成员。其基因组由单股正链RNA组成，约为10.5kb，由一个开放阅读框组成，共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白，该病毒在3′末端没有poly-A尾巴，病毒粒子由一个外壳蛋白(C)，一个膜蛋白(E)，一个小的非糖基化蛋白(M)，7个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)组成。在大多数黄病毒中，E蛋白定位于病毒粒子表面，病毒在与受体结合、侵入、细胞融合过程中起重要作用^[1-2]。

2010年4月以来，一种引起产蛋量急剧下降的新型传染病在中国各地的水禽饲养区大面积爆发，感染鸭的种类包括：北京鸭、番鸭、麻鸭、鹅等^[3-5]。该病引起高达100％的发病率和小于5％的死亡率，产蛋率在5天内降至10％左右。剖检后发现病鸭具有严重的卵巢出血、卵巢炎、卵巢萎缩现象。由于该病导致繁殖力的急剧下降给许多养殖场带来了严重的经济损失。经过病毒分离和鉴定，该病毒鉴定为鸭坦布苏病毒(在本发明中也简称为“坦布苏病毒”)。

该病近年来在我国一些省、市、自治区均有流行，给水禽养殖业造成经济损失惨重。国内外用于坦布苏病毒病诊断方法为病毒常规分离和鉴定。病毒分离和鉴定技术(诊断过程需7-10天时间)，费时、费力，还需要专业人员和电镜等设备；很难在临床上推广和应用。为此急需建立一种敏感、准确、快速、简便的鸭坦布苏病毒病抗体检测方法。酶联免疫吸附试验(ELISA)是广泛用于动物疾病诊断的一种方法，更适合短时间内检测大批量的血清样品，具有较好的特异性和较高的灵敏度。

随着我国人民生活水平的提高，水禽养殖业的迅猛发展，水禽发生坦布苏病毒病的比率也随之上升。因此，急需研制和开发坦布苏病毒抗体监测试剂盒，为国内的坦布苏病毒的防治提供技术支持。国外科研小组的报告中，已经证明E蛋白是坦布苏病毒的主要免疫原性蛋白，免疫原性好，可诱导机体产生免疫保护性抗体。通过对国内不同的分离株序列的比较分析，设计E蛋白PCR引物，E蛋白原核表达纯化后，以其为包被抗原建立了一种快速检测坦布苏病毒抗体的ELISA方法。

发明内容

本发明提供一种以鸭坦布苏病毒E蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验(E-ELISA)检测试剂盒，所述试剂盒包含标准对照阳性鸭血清、标准对照阴性鸭血清、鸭坦布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鸭酶标二抗及其它试剂，将标准对照阳性鸭血清、标准对照阴性鸭血清、鸭坦布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鸭酶标二抗及其它试剂组装，即得到所述试剂盒，其他成分包括样品稀释液，10×浓缩洗液，TMB底物显色液，终止液，所述试剂盒特征在于酶标ELISA板的包被抗原为纯化的原核表达的坦布苏病毒E蛋白，经过定量后包被ELISA板后得到；阳性标准血清为鸭坦布苏病毒免疫无特定病原(SPF)鸭后得到，阴性标准血清为SPF鸭血清。

本发明制备的E-ELISA检测试剂盒用于鸭坦布苏病毒感染后的抗体检测。