[发明专利]通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合有效
| 申请号： | 201810399266.6 | 申请日： | 2018-04-28 |
| 公开（公告）号： | CN110184301B | 公开（公告）日： | 2023-02-24 |
| 发明（设计）人： | 杨辉 | 申请（专利权）人： | 辉大（上海）生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90 |
| 代理公司： | 中国专利代理(香港)有限公司 72001 | 代理人： | 黄登高;初明明 |
| 地址： | 201203 上海市浦东新区中国（上海*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 通过 tild crispr 实现 高效 精确 靶向 整合 | ||
1.一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：
a) 线性化供体DNA，所述线性化供体DNA为双链；
b) Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和
c) sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体;
其中，所述的线性化供体DNA的结构从5’到3’如式I所示：
E1-R1-L1-Z-L2-R2-E2 (I)
式中，
E1代表无或5’端酶切以后的残留序列；
R1代表5’端的同源臂；
L1为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；
Z代表待整合的靶基因；
R2代表3’端的同源臂；
L2为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；
E2代表无或3’端酶切以后的残留序列；
其中，所述的R1与所述基因组的靶位点的切割位点的上游侧序列是同源的，而所述的R2与所述基因组的靶位点的切割位点的下游侧序列是同源的；
所述的sgRNA靶向结合于所述基因组的靶位点；
所述的sgRNA和所述Cas9蛋白对所述基因组的靶位点进行定点切割。
2.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述待整合的靶基因Z的序列长度为1bp-20kb。
3.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述残留序列E1和E2的序列长度各自独立地为0-20bp。
4.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述残留序列E1和E2的序列长度各自独立地为0-10bp。
5.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述残留序列E1和E2的序列长度各自独立地为0-5bp。
6.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述残留序列E1和E2的序列长度各自独立地为0bp。
7.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R1和R2的序列长度各自独立地为100-2000bp。
8.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R1和R2的序列长度各自独立地为100-1500pb。
9.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R1和R2的序列长度各自独立地为200-1000bp。
10.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R1和R2的序列长度各自独立地为700-900bp。
11.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R1的序列长度D1和同源臂R2的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.8-1.2):(0.5-1.5)。
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