[发明专利]通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合

说明书

本发明提供了通过Tild‑CRISPR实现高效精确的靶向整合策略，具体地，本发明提供了一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，所述反应体系包括：供体DNA，所述供体DNA为双链；Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体。本发明提供的靶向整合策略的基因编辑效率显著高于其他现有的基因编辑技术，且它对插入片段没有长度的限制。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种通过Tild-CRISPR实现高效精确的基因靶向整合系统及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法极大地促进了基因突变的细胞和组织的原位校正。然而，通过同源重组(HR)实现的精确敲入效率通常是比较低的。在以往的研究中，非同源末端连接(NHEJ)或微同源臂介导的末端连接(MMEJ)为基础的方法被报道称通过体内切割获得没有同源臂或者短同源臂(5-25bp)的转基因供体促进了斑马鱼和小鼠中CRISPR介导的靶向整合。

然而，针对最有用的带有条件性等位基因的转基因模型小鼠以及人类胚胎中的基因敲入还没有被这些新方法实现。一个使用长单链DNA(ssDNA)作为供体的靶向策略Easi-CRISPR被报道称可以有效地获得带有条件性等位基因的小鼠(Quadros et al.,2017)。然而，使用ssDNA作为供体的Easi-CRISPR花费很大并且在插入片段上有长度限制(通常是小于1 kb)。

因此，本领域迫切需要开发出一种可以用于小鼠以及人类的高效精确的基因靶向整合策略。

发明内容

本发明的目的就是提供一种通过Tild-CRISPR实现的高效精确的基因靶向整合策略。在任何情况下，本发明的方法不用于以生殖为目的对人类配子、合子和胚胎进行基因操作。

在本发明的第一方面，提供了一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，所述反应体系包括：

a) 供体DNA，所述供体DNA为双链；

b) Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和

c) sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体;

其中，所述的供体DNA具有从5’到3’的式I结构：

E₁-R₁-L₁-Z-L₂-R₂-E₂ (I)

式中，

E₁代表无或5’端酶切以后的残留序列；

R₁代表5’端的同源臂；

L₁为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；

Z代表待整合的靶基因；

R₂代表3’端的同源臂；

L₂为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；

E₂代表无或3’端酶切以后的残留序列；

其中，所述的R1与所述基因组的靶位点的切割位点的上游侧(或左侧)序列是同源的，而所述的R2与所述基因组的靶位点的切割位点的下游侧(或右侧)序列是同源的。

在另一优选例中，所述的gRNA靶向结合于所述基因组的靶位点。

在另一优选例中，所述的gRNA和所述cas9蛋白对所述基因组的靶位点进行定点切割。