[发明专利]一种鼻上皮干细胞培养方法及鼻上皮干细胞增殖培养基

权利要求书

1.一种鼻上皮干细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在培养皿中铺滋养层细胞；

2)从鼻黏膜组织中分离鼻上皮干细胞原代细胞；

3)将鼻上皮干细胞原代细胞铺在滋养层细胞上，将培养基替换为鼻上皮干细胞增殖培养基，移除其余的组织细胞；

4)当鼻上皮干细胞增殖到80％密度，通过胰酶消化，传代继续扩增；

5)将鼻上皮干细胞转移到气-液相培养体系和PneumaCult-ALI分化培养基进行分化培养；

所述步骤3)中的鼻上皮干细胞增殖培养基，组分及其终浓度为：DMEM/F12、胎牛血清、青霉素：100x、链霉素：100x、胰岛素：1-10mg/mL、表皮生长因子：1-20μg/mL、氢化可的松：50-1000μg/mL、3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠：1-20x10^-4M、ROCK抑制剂：0.5-10mM。

2.根据权利要求1所述的鼻上皮干细胞培养方法，其特征在于：步骤1)中，所述滋养层细胞为丝裂霉素处理过的3T3细胞，在12-24小时内可以顺利贴壁。

3.根据权利要求2所述的鼻上皮干细胞培养方法，其特征在于：步骤1)中，所述滋养层细胞的培养具体如下：采用DMEM培养基、10％胎牛血清以及1x青霉素-链霉素复合液培养3T3细胞；3T3细胞增殖到90％密度，进行丝裂霉素处理，丝裂霉素的处理浓度为0.5-20ug/mL；生长被抑制的滋养层细胞3T3细胞被消化后，按照密度0.1-1x10⁴cells/cm²预先铺在细胞培养皿中。

4.根据权利要求1所述的鼻上皮干细胞培养方法，其特征在于：

步骤3)中，在滋养层细胞贴壁后，鼻上皮干细胞原代细胞按照密度1-5x10³/cm²铺在滋养层细胞之上，并且将培养基替换为鼻上皮干细胞培养基，通过换液移除其余的组织细胞；培养条件为37℃，5％CO₂，每隔2-3天换液。

5.根据权利要求1所述的鼻上皮干细胞培养方法，其特征在于：

步骤3)中，还包括在第一代的鼻上皮干细胞增殖培养基中加入霍乱毒素，纯化鼻上皮干细胞。

6.根据权利要求5所述的鼻上皮干细胞培养方法，其特征在于：所述霍乱毒素的使用浓度为0.005-0.05μg/mL。

7.根据权利要求1所述的鼻上皮干细胞培养方法，其特征在于：

步骤5)中，将鼻上皮干细胞按照细胞密度1-10x10⁴/cm²转移到TRANSWELL小室，首先使用鼻上皮干细胞增殖培养基，增殖3-5天，把小室内培养基移除，小室外换用PneumaCult-ALI分化培养基，形成一个气-液相培养系统。

8.一种鼻上皮干细胞增殖培养基，其特征在于，包括以下组分及终浓度：DMEM/F12、胎牛血清、青霉素：100x、链霉素：100x、胰岛素：1-10mg/mL、表皮生长因子：1-20μg/mL、氢化可的松：50-1000μg/mL、3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠：1-20x10^-4M、ROCK抑制剂：0.5-10mM。

9.根据权利要求8所述的鼻上皮干细胞增殖培养基，其特征在于：所述鼻上皮干细胞增殖培养基的组分还包括加入霍乱毒素，所述霍乱毒素的使用浓度为0.005-0.05μg/mL。