[发明专利]一种鼻上皮干细胞培养方法及鼻上皮干细胞增殖培养基

说明书

本发明公开了一种鼻上皮干细胞培养方法，包括以下步骤：1)在培养皿中铺被滋养层细胞；2)从鼻黏膜组织中分离鼻上皮干细胞原代细胞；3)将鼻上皮干细胞原代细胞铺在滋养层细胞上，将培养基替换为鼻上皮干细胞增殖培养基，移除其余的组织细胞；4)当鼻上皮干细胞增殖到80％密度，通过胰酶消化，传代继续扩增；5)将鼻上皮干细胞转移到气‑液相培养体系和PneumaCult‑ALI分化培养基进行分化培养。本发明还公开了一种鼻上皮干细胞增殖培养基，包括以下组分：DMEM/F12、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰岛素、表皮生长因子、氢化可的松、3,3',5‑三碘‑L‑甲腺原氨酸钠、ROCK抑制剂。本发明为鼻上皮干细胞临床移植的转化应用提供关键的实施基础。

技术领域

本发明属于成体干细胞技术领域，特别涉及一种鼻上皮干细胞培养方法及鼻上皮干细胞增殖培养基。

背景技术

成体干细胞是指存在于组织中的未分化细胞，这类细胞能够自我更新，并且在特定条件下，按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织或器官保持生长和衰亡的动态平衡。胚胎干细胞具有全能性和可以建系传代，能永生化且增殖能力强，但是其缺点很明显，比如免疫排斥、非定位性分化、以及有可能引发癌变等。相比之下，成体干细胞来源于个体自身，不存在组织相容性的问题，避免移植排斥反应，还具有组织特异性的增殖和定向分化潜能，是最适合用于局部器官损伤后(特别是不可逆损伤)组织再生的临床应用。

目前已经有皮肤的上皮干细胞用于表皮的修复和再生，肺干细胞也已经有动物实验证实可应用在肺损伤后的肺上皮再生。成体干细胞必须从特定的组织中获得，比如表皮、肺、肠道上皮干细胞必须分别从皮肤、肺组织和肠道组织中分离出来，因此，成体干细胞也属于一类原代细胞。目前已有商品化的针对不同组织来源的原代细胞培养基，可以特异性培养该组织来源的原代细胞，使细胞能在体外进行增殖和分化为功能细胞，但是只能满足针对原代细胞的相关基础和临床研究，还未应用在临床干细胞治疗(如细胞移植)。

鼻黏膜上皮是人体呼吸道的第一道防线，其通过纤毛细胞的纤毛摆动和杯状细胞的粘液分泌，维持着黏膜重要的防御功能和稳态。应对外界的刺激(如病毒、细菌、环境刺激物)造成的损伤，鼻上皮干细胞有自我修复能力，通过上皮干细胞的迁移、增殖和定向分化而达到鼻黏膜的再上皮化。然而，在病理条件下造成的损伤(如急慢性鼻黏膜炎症、病毒或细菌的感染、环境有害物质的刺激、鼻腔鼻窦手术后的创伤和外伤、以及鼻咽癌放疗后的黏膜损伤)，鼻黏膜上皮修复和再生能力受损或缺失，难以再上皮化或再上皮化的时间延长，将导致黏膜炎症难以缓解，极大影响患者的生存质量。因此，如何使鼻黏膜上皮在损伤后快速的再上皮化并且恢复功能是解决黏膜炎症损伤病变的关键。

尽管针对上皮的治疗可以考虑从靶向炎症因子或优化现有的抗炎治疗方案的方向探讨，但这些方法可能适合特定的慢性鼻黏膜炎症，而对于不可逆的上皮损伤或上皮再生能力下降的情况(如急性的感染或环境有害物质造成上皮干细胞大量死亡、术后的黏膜创伤或外伤、以及射线造成的损伤)，则需要研究新的解决方案。

鼻上皮干细胞作为一种成体干细胞，其体外增殖和分化的能力使之具有非常好的临床应用前景。鼻原代上皮干细胞需要从鼻黏膜组织中分离并在体外培养，已有商业化的培养基(如LONZA公司的BEGM，Stemcell公司的PneumaCult)用于鼻上皮原代细胞的培养；申请人的课题组在前期也已经开发优化的培养体系，对维持鼻上皮干细胞的干性有较大的提升。以上的培养方法和体系仅能满足常规的上皮干细胞功能和特性相关的研究。