[发明专利]纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法

说明书

本发明公开纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，包括如下步骤：(1)将第一单克隆抗体偶联于第一磁性纳米酶颗粒上，获得捕获探针；(2)将第二单克隆抗体偶联于第二磁性纳米酶颗粒上，获得检测探针；(3)将待测样品与捕获探针温育；(4)从步骤(3)的溶液中得到捕获探针‑抗原复合物；(5)重悬捕获探针‑抗原复合物，加入检测探针，温育；(6)从步骤(5)的溶液中得到捕获探针‑抗原‑检测探针复合物；(7)加入过氧化物和催化底物显色，通过酶联仪检测溶液的光吸收值；(8)测量已知浓度的生物分子，绘制标准曲线，从而获得待测生物样品中的抗原含量。该方法操作步骤简单快捷，且对环境友好，适合各种化学或生物分子的检测。

技术领域

本发明涉及纳米材料及生物医学纳米技术领域。更具体地，涉及一种纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法。

背景技术

随着纳米技术的快速发展，纳米材料特别是磁性纳米颗粒在生物医学领域引起了人们极大的研究兴趣。磁性纳米颗粒是一类智能型的纳米材料，既具有纳米材料所特有的性质，如粒径小、比表面积大、偶联容量高，又具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热。利用这些特性磁性纳米颗粒被应用于生物标记与分离、核磁共振成像、组织修复、药物载体以及疾病诊断与治疗等方面。

近年，阎锡蕴课题组发现磁纳米颗粒具有过氧化物酶的催化功能(NatureNanotechnology.2007)并研制了三功能(识别、催化、磁性)于一体的新型检测试剂，发现磁颗粒表面包裹蛋白分子后仍然具有酶活性(阎锡蕴等，NatureNanotechnology.2012)。这种催化活性与辣根过氧化物酶相似，在过氧化氢存在下，磁性纳米颗粒可以催化辣根过氧化物酶的底物，如可以催化3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)生成蓝色的产物，催化二氨基联苯胺(DAB)生成棕色沉淀，催化邻苯二胺(OPD)生成橘红色产物，催化活性依赖于pH值、温度和过氧化氢浓度，其催化机理符合乒乓机制。同时还发现磁性纳米颗粒的催化活性随着颗粒粒径的减小而增强，颗粒的粒径越小，其催化活性越高。磁性颗粒的粒径达微米量级后，催化活性降低至接近零值。

与蛋白酶相比，磁性纳米颗粒具有更多的优势：(1)蛋白酶在极端pH和温度下容易变性，同时也容易被蛋白酶降解，而磁性纳米颗粒在极端条件下很稳定；(2)蛋白酶的生产成本很高，而磁性纳米颗粒制备简单、廉价；(3)由于磁性纳米颗粒具有超顺磁性，用磁铁可以回收反复利用；同时基于磁性纳米颗粒的磁可控性，拓展了其作为模拟酶的应用领域。

传统的分离技术主要包括沉淀、离心等过程，这些纯化方法的步骤繁杂、费时长、收率低，接触有毒试剂，很难实现自动化操作。而磁分离技术具有快速、简便的特点，能够高效、可靠地捕获特定的蛋白质或其它生物大分子。基于磁性纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场下纳米颗粒被磁化，然而一旦去掉磁场，它们将立即重新分散于溶液中，通常磁分离技术主要包括以下两个步骤：(1)将要研究的生物实体标记于磁性颗粒上；(2)利用磁性分离设备将被标记的生物实体分离出来。目前，磁分离方法已经拓展到对细胞、蛋白质和核酸(DNA，RNA)等多种生物的分离和纯化。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新颖的夹心免疫检测技术检测生物分子的方法，该方法集磁性纳米颗粒过氧化物酶催化活性及磁分离特性于一体，可以省略传统ELISA方法中引入辣根过氧化物酶标记抗体的步骤，基于此新技术的生物样本检测，简便快速。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，包括如下步骤：

(1)将第一单克隆抗体偶联于第一磁性纳米酶颗粒上，获得捕获探针；

(2)将第二单克隆抗体偶联于第二磁性纳米酶颗粒上，获得检测探针；

(3)将待测样品与捕获探针温育；

(4)第一次分离：从步骤(3)的溶液中得到捕获探针-抗原复合物；