[发明专利]一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌的方法和应用

说明书

本发明属于微生物学领域，公开了一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌（简称Bt）的方法和应用。本发明提供的方法，通过连续三步不同策略的选择性培养，使样品中Bt细胞的绝对生物量和相对比例均大幅度提高，需要挑取转接培养和镜检的菌落数减少，分离效率大大提高，操作更加简便；同时需要的样品量减少，可实现高通量操作，特别适用于从样品量很小的样品或Bt生物量很小的样品中分离Bt菌株。

技术领域

本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌(简称Bt)的方法和应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前应用最成功最广泛的生防微生物之一，在生物杀虫剂和转基因抗虫育种方面具有重要的研究和应用价值。从自然界中分离Bt菌株是长期性基础性的工作，是生防资源挖掘最重要的内容。现存分离筛选Bt的方法有以下4种：

1.直接分离法

直接分离法是细菌通用的分离方法，方法是将样品制备成悬浮液，系列稀释后涂布到LB平板上培养出肉眼可见的单菌落，挑取芽胞杆菌特征的单菌落，转接到芽胞化培养基上培养至芽胞期，通过制片和显微镜观察，筛选具有伴胞晶体的菌落即为Bt菌株。该方法所用的LB培养基对Bt菌株没有选择性，所以受样品中其他芽胞杆菌的影响和干扰比较大，需要挑取鉴定的菌落数量很大，转接培养和制片镜检的工作量都很大，分离效率比较低。

2.乙酸钠分离法

该方法来源于1987年的一篇文献报道，方法是将样品在含有0.25M乙酸钠的LB液体培养基中培养，由于Bt的芽胞对乙酸钠敏感没有萌发，而其他芽胞杆菌萌发生长为营养细胞，然后将培养液进行高温处理，萌发的杂菌被杀灭，处于芽胞状态的Bt细胞由于耐热存活下来，最后通过后续的平板培养和制片镜检进行分离筛选。该方法的优点是通过芽胞萌发培养和高温处理滤除了大部分芽胞类细菌的干扰，后续需要挑取镜检筛选的菌落数减少，节省了时间和工作量；但该方法的缺点正如该文献中显示的，就是有少部分受测试的Bt菌株仍然能在0.25M乙酸钠LB培养基培养中萌发，导致在后续高温处理时被滤除，所以该方法容易造成潜在新型菌株的漏筛。

3.加热分离法

该方法由世界卫生组织在2002年提出，并被全球普遍采用。该方法与直接分离法比较类似，差别是在涂布LB平板之前对样品进行高温加热处理，营养细胞状态的细菌被灭活，芽胞状态的细菌得以保留。该方法的优点是排除了非芽胞类细菌的干扰，后续转接培养和镜检筛选的工作量相对比较小；但是该方法的缺陷是加热处理能够将样品中处于非芽胞状态的Bt细胞杀死，所以该方法不适合于含有营养细胞或萌发芽胞状态Bt菌株的样品。

4.芽胞化分离法

该方法是对加热分离法的改进，就是在加热之前先对样品进行芽胞化培养，使其中非芽胞状态的细菌芽胞化，从而避免在高温处理时被灭活。该方法的优点是增加了分离到非芽胞状态的Bt菌株的机会，但是其缺点是芽胞化培养的步骤对Bt菌株没有选择性，其他芽胞类细菌也同时芽胞化，不能通过高温处理滤除，需要挑取大量的菌落进行转接培养和镜检筛选，比较费时费力，分离的效率相对较低。

综上所述，现存的4种分离方法存在着各种缺陷，主要原因是Bt菌株虽然在自然界分布广泛，但多数不是优势种群，在分离过程的共培养中处于竞争劣势，所以导致现存分离方法的效率比较低，工作量比较大，难于实现高通量操作。

本发明提供的方法，通过连续三步不同策略的选择性富集培养，提高了Bt细胞在样品中的绝对生物量和相对比例，分离效率较高，工作量较少，操作简便，可实现高通量操作。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌的方法，方法高效，简单，准确率高。

本发明的另一个目的在于一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌的方法在筛选或分离苏云金芽胞杆菌中的应用。