[发明专利]一种猪粪抗生素抗性基因的定量检测方法

权利要求书

1.猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）提取经常服用抗生素猪的猪粪的DNA，以猪粪DNA为模板，采用PCR扩增目的抗性基因片段；

2）切胶回收纯化扩增后的目的抗性基因片段，将抗性基因连接在pGEM – T Easy载体上，然后转入感受态大肠杆菌，转化后大肠杆菌经培养后，涂LB平板，然后挑选阳性克隆子，用LB 培养液扩大培养；

3）用琼脂糖凝胶电泳检测扩大培养菌液的质量，挑选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，换算出质粒所携带抗性基因的拷贝数，并按10 倍为稀释梯度稀释备用，作为抗性基因标准品；

4）将猪粪样品DNA 和抗性基因标准品同时进行定量PCR 扩增，根据抗性基因标准品的拷贝数和其扩增的CT 值生成标准曲线，进而得出猪粪样品的抗性基因的拷贝数。

2.根据权利要求1 所述的土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于：

所述目的抗性基因为：四环素类抗性基因tetM 基因、tetO基因、tetW基因、tetT基因

所述目的抗性基因，其长度为168-171bp。

3.根据权利要求1所述的猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在

于：所述步骤3)中，质粒浓度换算成每μL质粒溶液所携带的绝对模板拷贝数的公式为：

Copies/μL ＝ [x/(a+b)×660]×10^-9×6.02×10²³，其中x为质粒浓度(ng/μL) ；a 为载体长度(bp) ；b 为目的抗性基因长度(bp)。

4.根据权利要求1所述的猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于：

所述步骤1) 中，PCR 扩增的反应体系体积为25μL：包括

5U·μL-1 Ex Taq DNA 聚合酶 0.125μL，

缓冲液10×Ex Taq buffer（含Mg^{2 +}）2.5μL，

浓度为2mmol·L-1 的dNTPs 2μL，

浓度为20μmol·L-1 的引物各0.25μL，

稀释10 倍的DNA 样品0.5μL

余量为二次重蒸水；

反应条件为：

94℃下预变性4min，94℃ 45s，退火45s ，72℃ 1min，35 个循环，最后72℃下延伸6min。

5.根据权利要求1所述的猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于：

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetM基因时，前后引物序列分别为

ACAGAAAGCTTATTATATAAC，TGGCGTGTCTATGATGTTCAC；退火温度为45℃；

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetO基因时，前后引物序列分别为

ACGGARAGTTTATTGTATACC，TGGCGTATCTATAATGTTGAC；退火温度为45℃；

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetT基因时，前后引物序列分别为

AAGGTTTATTATATAAAAGTG，AGGTGTATCTATGATATTTAC；退火温度40℃；

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetW基因时，前后引物序列分别为

GAGAGCCTGCTATATGCCAGC，GGGCGTATCCACAATGTTAAC；退火温度60℃。

6.根据权利要求1所述的猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于：定量PCR的反应体系为25μL，包括（约1.27 ng·μL^-1） 模板DNA 2μL，荧光染料SYBR Premix ExTaq12.5μL，前后引物各200 nmol·L^-1，定量PCR反应程序：

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetM基因时，定量PCR反应程序为95℃ 1min 后，40 个循环为94℃ 10s，45℃ 45s，80℃ 6s；

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetO基因时，定量PCR反应程序为95℃ 1min 后，40个循环为94℃10s，45℃ 45s，81℃ 10s；

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetT基因时，定量PCR反应程序为95℃ 1min 后，40个循环为94℃ 10s，40℃ 45s，79℃ 6s；

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetW基因时，定量PCR反应程序为95℃ 1min 后，40个循环为94℃ 10s，60℃ 45s，83℃ 10s。