[发明专利]一种猪粪抗生素抗性基因的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法，步骤为：1)选用经常服用抗生素猪的猪粪DNA为模板，采用PCR扩增目的抗性基因片段；2)切胶回收纯化扩增后的目的抗性基因，将抗性基因连接在T载体上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，涂LB平板后挑选阳性克隆子；3)用琼脂糖凝胶电泳检测扩大培养菌液的质量，选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，换算出质粒所携带抗性基因的拷贝数，并按10倍为稀释梯度稀释备用，作为抗性基因标准品；4)提取猪粪样品的基因组DNA，将猪粪样品DNA和抗性基因标准品同时进行定量PCR扩增，从而最终得出猪粪样品的抗性基因拷贝数。本发明不依赖于微生物培养，操作简单，检测速度高，灵敏度高，数量上也更为直观。

技术领域

本发明专利属于环境工程技术领域，具体涉及一种猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法。

背景技术

四环素是一类常见的抗生素，作为兽药和促生长剂大量用于畜牧养殖业。研究证明大部分抗生素难以被动物吸收利用，约25~75%的抗生素未经代谢而以母体化合物形式随粪尿排出体外。在环境中，抗生素会诱导环境中的微生物的耐药性产生选择压力， 诱导产生四环素抗性基因（ARGs）。抗性基因具有较强的横向转移能力，其可以在土壤、地下水及各个环境介质中迁移、转化，并很可能随抗性质粒等被带入食物链并最终进入人体，增加人体的抗生素耐药性. 一旦这些抗性基因从环境微生物进入到致病菌中，就会对人类健康构成潜在威胁。因此，残留有抗生素的粪尿排放到环境中或使用残留有抗生素的粪便作为有机肥施用到农田中，对人体健康以及整个生态系统构成长期潜在危害。

抗生素抗性基因作为一种新型的环境污染，种类繁多，数量巨大，比如截至目前，四环素类抗性基因就有三大类超过四十种，建立猪粪中抗性基因的定量检测方法，对于进一步系统地监测畜禽养殖污染物中抗生素抗性基因及其评价其生态风险有重要意义，同时对于抗性基因畜禽养殖污染源的控制也有重要意义。目前，猪粪抗性基因提取研究中，没有商品化的猪粪抗性基因标准品，而且普通PCR 只能定性的检测基因的有无，而且灵敏度不高。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明专利提供一种猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法。其具体步骤如下：

1) 选用经常服用抗生素的猪，服用的抗生素种类应包括目的抗性基因所对应的抗生素；用猪粪基因组提取试剂盒(Fast DNA spin kit for manure) 提取猪粪的基因组DNA，并以猪粪DNA为模板，采用PCR扩增目的抗性基因片段，其长度应该在168-171bp，目的抗性基因种类主要有四环素类抗性基因tetM基因、tetO基因、tetW基因、tetT基因；

2）采用DNA 凝胶纯化试剂盒纯化扩增后的目的基因片段，将片断连接在pGEM – TEasy 载体上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，涂平板后挑选阳性克隆子（白色菌斑）重新接入LB液体培养基中培养，然后使用培养液蘸取少量模板用M13-RV47进行扩增，若为阳性，则用LB 培养液扩大培养，然后取1mL菌液测序验证插入基因片断；

3）挑选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，换算出质粒所携带抗性基因的拷贝数，并按10 倍为稀释梯度稀释备用，作为抗性基因标准品；

4）将猪粪样品DNA和抗性基因标准品同时进行定量PCR扩增，根据抗性基因标准品的拷贝数和其扩增的CT值生成标准曲线，进而得出猪粪样品的抗性基因的拷贝数。

本发明专利中，质粒浓度换算成每μL质粒溶液所携带的绝对模板拷贝数的公式为：Copies/μL ＝ [x/(a+b)×660]×10^-9×6.02×10²³，其中x为质粒浓度(ng/μL) ；a为载体长度(bp)；b为目的抗性基因长度(bp)。