[发明专利]一种通过均质器高效胎盘间充质干细胞的制备方法

说明书

本发明涉及胎盘来源的间充质干细胞的分离及其纯化，属于干细胞和组织工程领域。经产妇及其家属同意，得到其剖腹产后的胎盘，立即放入加有多种抗生素的储存液中短期保存。胎盘在实验室内反复清洗血水后进行粉碎，胶原酶消化的同时进行均质器的拍打，从而获得细胞悬液。通过密度梯度离心发获得胎盘间充质干细胞。通过使用均质器分离胎盘间充质干细胞的效率高传统方法数倍，降低酶解时间，提高成功率。所获得的间充质干细胞具有与骨髓来源的间充质干细胞类似的体外扩增能力和多向分化潜力，是组织工程和细胞治疗潜在的种子细胞来源，具有重要的临床意义。

发明领域

本发明涉及胎盘来源的间充质干细胞及其分离纯化，属于干细胞与组织工程领域。

背景技术

近年来面临持续流行的组织工程和细胞治疗的首要问题是种子细胞的来源。由于干细胞在体外具有一定的自我更新能力，而且在特定的诱导条件下具有分化为一种或多种，甚至人体内全部类型细胞的潜力，逐渐吸引了科研工作者的注意力，恰巧可以解决自体组织细胞来源匮乏且扩增困难，在体外培养过程中容易丢失表型的问题。因此，干细胞显示出很好的临床应用前景。从目前的研究报道中可知，成功分离纯化的干细胞包括两种：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞 (Embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞研究一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。由于人类对胚胎干细胞本身在分离、培养、诱导分化和免疫原性等方面上的认识和控制上的不足，潜在的致癌、致畸危险，且现如今舆论导向的影响，胚胎干细胞短期内还不能全面应用于临床治疗上。另一方面，成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够定向分化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。目前研究最多的是来源于骨髓的间充质干细胞，其他包括脂肪、肌肉、神经、牙髓等组织中也发现了间充质干细胞的存在，但它们的获取和分离相对骨髓来说较为困难。但从这些组织中获得间充质干细胞时会对献者造成一定的创伤，献者多会有所顾虑。况且，这些高度分化的组织中获得的间充质干细胞通常具有一定的抗原性，在异体移植中会有免疫排斥的反应，且收获量较少，需要花费大量的时间和金钱进行体外扩增培养，所以在临床应用中会受到很大的限制。有鉴于此，寻求一种容易获得、免疫原性较小、且收获量较大的成体干细胞来源具有非常重要的实际应用价值。

胎盘是受精卵在母体子宫着床后，子宫内膜发育的蜕膜和胎儿的叶状绒毛膜结合形成的组织。胎盘为胎儿进行营养、呼吸和排泄的器官，并产生分泌素。当分娩时，先是子宫收缩，然后子宫口扩张，胎儿突破羊膜产出，结扎并剪断脐带；最后子宫再次收缩，由底蜕膜的海绵层与子宫壁分离，将胎盘及胎膜排出。人胎盘是一种重要的、优良的人源性蛋白类药物。20世纪70年代以后，随着分子生物学、细胞生物学等研究及人类基因组计划的实施，人类对人体生理学调节机制及疾病发病机制认识呈指数发展，许多重大的生物医学方面的突破都原自哺乳动物内那些具有重要生物学活性的物质的发现。近年来的研究表明，胎盘组织中具有大量与骨髓间充质干细胞类似的贴壁细胞。国内很多报道关于利用酶解或者灌注的方法成功从胎盘组织中获得具有体外扩增能力和多向分化潜力的贴壁细胞。胎盘在胎儿出生后就失去了发挥其强大生理功能的作用，通常作为医疗废弃物被处理掉。而且胎盘作为一味中药应用于医疗方面在中国已延续千年。因此，胎盘可以成为间充质干细胞潜在的丰富来源。目前国内外关于胎盘来源贴壁细胞的分离提取及纯化扩增的技术很多，细胞收率也各有差异。本发明的目的在于公开一种从胎盘中大量分离提取间充质干细胞的方法，具体涉及到细胞从胎盘组织中的分离与纯化，体外的扩增与培养。

发明内容