[发明专利]一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法在审
| 申请号： | 201810408419.9 | 申请日： | 2018-05-02 |
| 公开（公告）号： | CN108828226A | 公开（公告）日： | 2018-11-16 |
| 发明（设计）人： | 彭美玉 | 申请（专利权）人： | 潍坊医学院 |
| 主分类号： | G01N33/68 | 分类号： | G01N33/68;G01N15/14 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人： | 刘奇 |
| 地址： | 261000 山东*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 染色 透膜 分泌细胞因子 外周血白细胞 染色缓冲液 缓冲液 检测率 细胞 检测 细胞因子分泌细胞 红细胞 牛血清白蛋白 细胞表面标记 细胞因子抗体 流式细胞仪 培养液稀释 统计学意义 多聚甲醛 全血标本 实验数据 小鼠血清 钙离子 避光 醇脂 抗体 全血 溶解 封闭 | ||
1.一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取500μl全血加500μl不完全rpmi-1640培养液稀释，得混合物A；
S2、培养：向混合物A中加入终浓度为15～25ng/ml的佛波醇脂和终浓度为0.5～1.5μg/ml的钙离子酶素，得混合物B，然后将混合物B在24孔培养板内培养6h，且在培养的后4h加入终浓度为2～3μmol/L的莫能酶素阻断细胞因子分泌，培养后即为待检测细胞；
S3、染色：取步骤S2培养后的待检测细胞100μl，加入细胞表面标记抗体，在4℃条件下避光染色30min，再用全血标本溶解红细胞，然后用1ml染色缓冲液洗2次，加入500μl质量浓度为2％的多聚甲醛，在4℃条件下避光固定30min，加500μl透膜缓冲液，在4℃条件下避光透膜15min，加入20μl质量浓度为5％的牛血清白蛋白和5μl小鼠血清，在4℃条件下避光封闭30min,加入细胞因子抗体，在4℃条件下避光染色30min，加入1ml透膜缓冲液洗2次，最后加入1ml染色缓冲液洗1次，得染色后的细胞；
S4、将步骤S3得到的染色后的细胞在流式细胞仪FACSCalibur上进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述培养的温度为37℃，培养环境中CO2的浓度为5％。
3.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述佛波醇脂的终浓度为20ng/ml，钙离子酶素的终浓度为1μg/ml，莫能酶素的终浓度为2.5μmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述细胞表面标记抗体为CD3-PeCy5.5、CD4、TCRγδ-PE中的任意几种。
5.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述染色缓冲液为5％胎牛血清、0.1％叠氮钠和余量的磷酸缓冲液的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述透膜缓冲液为质量浓度为0.1％的皂素。
7.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述细胞因子抗体为IL-17A、IFN-γ、IL-4或IL-22中的任意几种。
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