[发明专利]一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法

说明书

本发明公开了一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，包括以下步骤：S1、取全血加培养液稀释；S2、加佛波醇脂和钙离子酶素，培养6h，且在培养的后4h加入莫能酶素，得待检测细胞；S3、取待检测细胞加细胞表面标记抗体染色，用全血标本溶解红细胞，染色缓冲液洗，加多聚甲醛避光固定，加透膜缓冲液透膜，加牛血清白蛋白和小鼠血清封闭,加细胞因子抗体染色，加透膜缓冲液洗，加染色缓冲液洗，得染色后的细胞；S4、在流式细胞仪上进行检测。本发明提出的方法，适用范围广，细胞因子分泌细胞的比率高，且实验数据与对照组数据具有统计学意义。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法。

背景技术

流式细胞仪法是目前大多数研究者检测外周血标本中分泌细胞因子的常用方法。实验中，大家往往习惯上将外周血标本中的单个核细胞(PBMC)分离或直接将T细胞亚群分选后进行检测。然而对于一些分泌量比较少的细胞因子，如IL-17、IL-4、IL-22等，因为最后得到的数据都比较低，所以很多实验数据在与对照组比较时没有统计学意义。因为一种细胞因子的分泌需要其它细胞因子的辅助作用，而血清中存在多种细胞因子，如Manel N等人报道，在无血清存在时，初始CD4+T细胞分泌IL-17依赖于TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-21或IL-23的存在(Nat Immunol.2008Jun；9(6):641-9)。基于此，本发明提出了一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法。

一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，包括以下步骤：

S1、取500μl全血加500μl不完全rpmi-1640培养液稀释，得混合物A；

S2、向混合物A中加入终浓度为15～25ng/ml的佛波醇脂和终浓度为0.5～1.5μg/ml的钙离子酶素，得混合物B，然后将混合物B在24孔培养板内培养6h，且在培养的后4h加入终浓度为2～3μmol/L的莫能酶素阻断细胞因子分泌，培养后即为待检测细胞；

S3、取步骤S2培养后的待检测细胞100μl，加入细胞表面标记抗体，在4℃条件下避光染色30min，再用全血标本溶解红细胞，然后用1ml染色缓冲液洗2次，加入500μl质量浓度为2％的多聚甲醛，在4℃条件下避光固定30min，加500μl透膜缓冲液，在4℃条件下避光透膜15min，加入20μl质量浓度为5％的牛血清白蛋白和5μl小鼠血清，在4℃条件下避光封闭30min,加入细胞因子抗体，在4℃条件下避光染色30min，加入1ml透膜缓冲液洗2次，最后加入1ml染色缓冲液洗1次，得染色后的细胞；

S4、将步骤S3得到的染色后的细胞在流式细胞仪FACSCalibur上进行检测。

优选的，所述培养的温度为37℃，培养环境中CO₂的浓度为5％。

优选的，所述佛波醇脂的终浓度为20ng/ml，钙离子酶素的终浓度为1μg/ml，莫能酶素的终浓度为2.5μmol/L。

优选的，所述细胞表面标记抗体为CD3-PeCy5.5、CD4、TCRγδ-PE中的任意几种。

优选的，所述染色缓冲液为5％胎牛血清、0.1％叠氮钠和余量的磷酸缓冲液的混合物。

优选的，所述透膜缓冲液为质量浓度为0.1％的皂素。

优选的，所述细胞因子抗体为IL-17A、IFN-γ、IL-4或IL-22中的任意几种。