[发明专利]一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用

权利要求书

1.一种高产γ-PGA的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）的制备方法，通过将地衣芽胞杆菌WX-02中的cimH基因敲除后得到，所述的cimH基因为SEQ ID NO.1所示。

2.一种高产γ-PGA的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）的制备方法，包括下述步骤：

（1）以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增出cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂；

（2）通过重叠延伸PCR将cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：cimH基因的上游同源臂-cimH基因的下游同源臂；

（3）采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

（4）将步骤（2）得到的酶切目的片段和步骤（3）得到的线性质粒片段经 T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以卡那青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序得到敲除质粒T2(2)-△cimH；

（5）将敲除质粒T2(2)-△cimH转入地衣芽胞杆菌WX-02中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

（6）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到cimH基因的上游同源臂或cimH基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（7）挑选cimH基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与cimH基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到缺失了cimH基因的地衣芽胞杆菌WX-02△cimH；

所述cimH基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.利用权利要求1所述的方法制备得到的地衣芽胞杆菌在生产聚-γ-谷氨酸中的应用。