[发明专利]一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用

说明书

本发明涉及生物技术和发酵领域，公开了一种高产聚γ‑谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用，本发明以质粒T2(2)‑Ori为基础，通过构建柠檬酸转运蛋白基因cimH的敲除载体T2‑△cimH，成功在地衣芽胞杆菌WX‑02中敲除了cimH基因，得到了地衣芽胞杆菌工程菌WX‑02△cimH。与对照菌WX‑02相比，工程菌株WX‑02△cimH的γ‑PGA产量至少提高了11%以上，为γ‑PGA高产提供一种新的策略。

技术领域

本发明涉及生物技术和发酵领域，具体涉及一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用。

背景技术

聚γ-谷氨酸(Poly glutamic acid,γ-PGA)是一种由D-谷氨酸、L-谷氨酸或D，L-谷氨酸组成的阴离子型谷氨酸聚合物，相对分子量在10KD-3000KD。根据谷氨酸单体间酰胺键连接方式可分为聚α-谷氨酸和聚γ-谷氨酸，γ-PGA分子链存在着游离羧基，分子与分子之间作用的氢键由游离羧基提供，因此γ-PGA有着诸多特点：易溶于水；良好的保水能力；吸附金属离子；主链由肽键构成，在酶降解下可以降解成短肽或单体氨基酸，因此具有可生物降解性；耐热，耐紫外线。γ-PGA还可以作为药物载体、组织工程材料、化妆品添加剂和食品添加剂等。

作为三羧酸循环重要的中间代谢物—柠檬酸，是γ-PGA合成过程当中不可或缺的物质，同时也是一种良好的金属离子的螯合剂。柠檬酸在菌体代谢过程中会有部分合成，但合成量较低，不足以满足目标产物的合成需求。

本申请发现，通过敲除地衣芽胞杆菌中柠檬酸转运蛋白基因cimH，进而提高了柠檬酸利用效率和γ-PGA的合成量。目前对于γ-PGA高产策略一般集中在途径改造和转录调控，本发明首次通过敲除地衣芽胞杆菌中柠檬酸转运蛋白基因来提高γ-PGA产量，为γ-PGA高产提供一种新的策略。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法，该方法通过在地衣芽胞杆菌的基因组内敲除cimH基因，缺失柠檬酸/苹果酸转运蛋白，提高了γ-PG A产量。

本发明的另一个目的在于提供了一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法的应用。利用本发明的方法，可用于工业化制备聚γ-谷氨酸。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的制备方法，通过将地衣芽胞杆菌中的cimH基因敲除后得到。

以上所述的方法中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02；

以上所述的方法中，具体的，包括下述步骤：

(1)以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增出cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂；

(2)通过重叠延伸PCR将cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：cimH基因的上游同源臂-cimH基因的下游同源臂；

(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

(4)将步骤(2)得到的酶切目的片段和步骤(3)得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以卡那青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序得到敲除质粒T2(2)-△cimH；