[发明专利]促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离原代脐带静脉内皮细胞并进行细胞培养及传代；

(2)向传代培养的内皮细胞培养液中加入山莨菪碱对内皮细胞进行处理，然后更换新的内皮细胞培养液继续培养内皮细胞18-30小时，所述山莨菪碱的浓度为1.5×10^-2―1.5×10^-3ng/mL，加入山莨菪碱后，处理的时间为3-5小时；

(3)自内皮细胞培养后得到的的内皮细胞培养液中提取外泌体；

(4)外泌体鉴定。

2.根据权利要求1所述的促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂的制备方法，其特征在于，所述传代培养的内皮细胞为3-5代内皮细胞。

3.根据权利要求1所述的促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂的制备方法，其特征在于，所述内皮细胞培养液为基础培养基中添加无外泌体胎牛血清、青霉素、链霉素和内皮生长因子至终浓度分别为0.05mg/mL、0.01mg/mL、0.01mg/mL和0.01mg/mL。

4.根据权利要求1所述的促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取外泌体的具体步骤为：收集步骤(2)中内皮细胞培养后的内皮细胞培养液上清，300g、4℃、离心10分钟，取上清液，16500g、4℃、离心20分钟，取上清液经0.2μm孔径滤膜过滤，取滤液经120000g、4℃、离心2小时，去上清，将沉淀溶于0.01M的PBS缓冲液。

5.根据权利要求1所述的促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中外泌体的的鉴定包括观察外泌体电镜形态、分析外泌体粒径及外泌体蛋白定量。

6.一种促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂，其特征在于，通过权利要求1至5任一项所述的方法制备得到。

7.根据权利要求6所制备的促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂在制备治疗微血管损伤、微循环障碍和心脑梗塞药物中的应用。