[发明专利]一种表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株，名称为rILTV△US9-NDV-F株，其微生物保藏号是：CGMCC No.14738。

2.一种权利要求1所述的表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建含有EGFP表达盒的重组转移载体：通过PCR扩增分别获得传染性喉气管炎病毒US9基因开放阅读框ORF两侧的侧翼序列，即左同源臂US9L和右同源臂US9R；将左同源臂US9L、右同源臂US9R分别插入PUC18载体中，获得中间载体pILT△US9；然后插入EGFP表达盒，获得重组转移载体pILTΔUS9-EGFP，该载体中EGFP表达盒上下游分别连有左同源臂US9L与右同源臂US9R；

所述EGFP表达盒是从pEGFP-N1载体上获得的，该表达盒由CMV启动子、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因以及PolyA终止子组成；所述EGFP表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

(2)提取传染性喉气管炎病毒的完整基因组DNA；

(3)利用步骤(1)中获得的重组转移载体pILTΔUS9-EGFP与步骤(2)中获得的传染性喉气管炎病毒的完整基因组DNA共转染LMH细胞，通过蚀斑纯化法获得表达EGFP的传染性喉气管炎重组病毒；

(4)构建NDV-F表达盒的重组转移载体：通过PCR扩增获得表达新城疫病毒F蛋白基因，将步骤(1)所述pILTΔUS9-EGFP重组载体中EGFP基因切除，然后插入上述新城疫病毒F蛋白基因，获得重组转移载体pILTΔUS9-NDV-F，该载体中NDV-F表达盒上下游分别连有左同源臂US9L与右同源臂US9R；

所述NDV-F表达盒由CMV启动子、NDV-F基因以及PolyA终止子组成；所述NDV-F表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(5)提取步骤(3)中获得的表达EGFP的传染性喉气管炎重组病毒的完整基因组DNA；

(6)利用步骤(4)中获得的重组转移载体pILTΔUS9-NDV-F与步骤(5)中获得的表达EGFP传染性喉气管炎重组病毒的完整基因组DNA共转染LMH细胞，通过蚀斑纯化法获得表达NDV-F的传染性喉气管炎重组病毒株；

步骤(1)、(4)所述左同源臂US9L，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；右同源臂US9R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根据权利要求2所述传染性喉气管炎重组病毒株的构建方法，其特征在于，步骤(1)、(4)所述左同源臂US9L与右同源臂US9R序列通过PCR扩增获得，扩增模板为鸡传染性喉气管炎病毒CK/CH/LHLJ/120305株基因组，引物设计所参考的序列GenBank登陆号为NC_006623.1，所述ILTV病毒CK/CH/LHLJ/120305,其微生物保藏号是：CGMCC No.15482；

所述左同源臂US9L扩增引物为：

上游引物US9L-F：5’-CGCGGATCCcagtaataataaccacac-3’，

下游引物US9L-R：5’-CGGGGTACCctgtcctccgtccactct-3’；

所述右同源臂US9R扩增引物为：

上游引物US9R-F：5’-AAACTGCAGggctacacaacagcaata-3’，

下游引物US9R-R：5’-CGCGGATCCgaccaactaatagctatc-3’。