[发明专利]ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一组用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQ IDNO：3所示，内参基因的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的一组用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述IDH1突变基因检测探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB荧光标记，内参基因的TaqMan探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB荧光标记。

3.一种基于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；

2)对所述的检测样本进行cfDNA抽取处理，从而获得cfDNA抽取物；

3)以步骤2)所得到的cfDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1变异基因和内参基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQ IDNO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，内参基因的TaqMan检测探针序列如SEQ ID NO：4所示；

4)对所述扩增产物进行分析，从而得出样本中IDH1多种变异的绝对含量以及相对与总DNA的比例。

4.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的方法，其特征在于，ddPCR反应体系中cfDNA模板的含量为0.3-2ng/μL。

5.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的方法，其特征在于，ddPCR反应体系中扩增IDH1突变基因和扩增内参基因的上游引物的含量均为400-700nM，扩增IDH1突变基因和扩增内参基因的下游引物的含量均为400-700nM。

6.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的方法，其特征在于，ddPCR反应体系中IDH1突变基因检测探针含量为200-400nM，内参基因的TaqMan检测探针含量为200-400nM。

7.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的方法，其特征在于，步骤3)中ddPCR反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟，93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。

8.根据权利要求7所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的方法，步骤3)中ddPCR反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火/延伸60秒，共进行40个循环，10℃终止反应。

9.一种用于绝对定量检测人IDH1基因变异的的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针。

10.根据权利要求9所述的一种用绝对定量检测人IDH1基因变异的的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：ddPCR Supermix、ddH2O、阳性标准品和微滴生成油中的至少一种。