[发明专利]ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种ddPCR技术检测IDH1多种基因变异的引物、试剂盒及检测方法。本发明提供的用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物和探针是根据IDH1基因的第4号外显子的野生型基因序列和相应突变基因序列设计的，结合PCR平台可以检测IDH1基因的第4号外显子的包括R132H、R132C、R132S、R132G、R132L和R132V的多种突变，并对样本所携带IDH1基因变异DNA进行绝对数量；且引物扩增片段为91bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，结合本发明提供的检测探针，可以从cfDNA中检测到极低丰度的IDH1基因变异，具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用于ddPCR平台对人IDH1基因变异进行绝对定量检测，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种ddPCR技术检测IDH1多种基因变异的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，不仅在能量代谢、氨基酸和维生素合成中扮演重要角色，而且对该酶的活性调节将直接影响IDH或IDH底物参与不同的生物途径、发挥不同的生物功能。在哺乳动物细胞中，IDH同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2，依赖NADP的细胞质IDH3。编码依赖NADP的人异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)的基因位于染色体2q33.3，目前发现的IDH1基因突变都发生在第4外显子的R132位，共发现了6种突变类型(包括R132H、R132C、R132S、R132G、R132L和R132V)，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1蛋白处于持续活性状态。

IDH突变超过90％是IDH1突变，几乎都是发生在酶的底物结合位点之一的残基R132的精氨酸。大约90％为精氨酸被组氨酸替代(R132H)，其他少见类型突变也都发生在R132残基，包括半胱氨酸(R132C；3.6％-4.6％)、丝氨酸(R132S；0.8％-2.5％)、甘氨酸(R132G；0.6％-3.8％)或亮氨酸(R132L；0.5％-4.3％)替代精氨酸。其中IDH1 R132C突变与星形细胞瘤密切相关。有研究者分析了Li-Fraumeni综合征家族(TP53种系突变)中星形细胞瘤患者的IDH1突变，发现所有肿瘤的IDH1突变都发生在R132C，表明已经携带TP53突变的前体细胞可以产生这个相对稀有的IDH突变。IDH1酶底物结合位点中还有另外两个保守的精氨酸残基(8100和8109)，仅有一篇报道称在两例间变性少突胶质细胞瘤(WHO III级)和一例星形细胞瘤(WHO II级)中存在R100Q突变。美国国家综合癌症网络(NCCN)临床实践指南也将有无IDH1/2基因突变作为评估低级别脑胶质瘤患者风险级别的指标之一。

德国已出现了商业化的对IDH1R132H高度特异的单克隆抗体，可实现在常规免疫组化中对突变基因编码的蛋白进行特异性检测。由于可以简单纳入常规组织病理学工作，该抗体在德国临床诊断中得到了广泛应用。但是，针对其他类型的IDH1突变(R132C，R132S，R132L，R132G)单克隆抗体尚未商业化生产。用单克隆抗体检测突变为突变表型检测，通过检测突变基因的表达蛋白来检测基因突变，但由于受到肿瘤细胞基因表达调控的影响，常常不能真实反映基因突变情况。因此，现阶段，考虑到胶质瘤中IDH突变与预后密切相关，还需通过基因检测的方法来判断IDH基因是否存在突变。

目前，对基因检测突变的分析的技术方法主要包括：测序、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、荧光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。

1.直接测序：Sanger测序法被认为是检测基因突变的金标准方法。但是，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，检测周期长，不易于形成标准化操作、适合临床单位应用的体外诊断产品。