[发明专利]用于MSTN基因敲除猪鉴定的功能核酸快速PCR方法与试剂盒

权利要求书

1.一种检测MSTN基因敲除猪成分的PCR方法，其特征包括，根据基因敲除位点,设计2条不同的正向引物和一条共用的反向引物；所述的其中一条正向引物是针对野生型检测的引物，该正向引物的序列如SEQ ID NO:3所示，该引物的3′端终止于对应的敲除位点，即SEQID NO:3所示序列的第42位和第43位的AG两个碱基处；所述的另一条正向引物是针对敲除型检测的引物，该正向引物的序列如SEQ ID NO:5所示，该引物的3′端跨越敲除位点，即SEQID NO:3所示序列的第42位和第43位的AG两个碱基处后再延伸两个碱基，即SEQ ID NO:5所示序列的第22位和第23位的CT两个碱基；针对用于野生型检测的正向引物的5′端进行功能核酸接头设计，即在正向引物的5′端添加20bp的功能核酸序列，该序列是GCTTATCTATAGCATTGAAG，使野生型的引物和敲除型的引物的扩增片段大小出现差异，通过PCR扩增，使MSTN基因被敲除猪、野生型猪及其杂合子猪能扩增出不同大小的片段，实现对基因敲除猪快速简便的检测。

2.一种检测MSTN基因敲除猪成分的PCR引物，其特征包括，采用下述引物组合对目标基因进行PCR扩增：

引物组合1：

正向引物MSTN-WT-F：GCTTATCTATAGCATTGAAGCCCTCTAACTGTGGATTTTGAAG；

反向引物MSTN-R：CACCCACAGCGATCTACTACCA；

得到如序列表SEQ ID NO:1所示序列的扩增片段；

和

引物组合2：

正向引物MSTN-KO-F：CCCTCTAACTGTGGATTTTGACT；

反向引物MSTN-R：CACCCACAGCGATCTACTACCA；

得到如序列表SEQ ID NO:2所示序列的扩增片段。

3.一种检测MSTN基因敲除猪的试剂盒，其特征包括，所述的试剂盒按照如下配置：

(1)PCR引物：

正向引物MSTN-WT-F：GCTTATCTATAGCATTGAAGCCCTCTAACTGTGGATTTTGAAG；

正向引物MSTN-KO-F：CCCTCTAACTGTGGATTTTGACT；

反向引物MSTN-R：CACCCACAGCGATCTACTACCA；

(2)相关试剂：

10×PCR Buffer、dNTP Mix、Taq聚合酶、阳性对照DNA模板、阴性对照DNA模板、空白对照双蒸水；

PCR扩增后，根据所得条带对基因型进行鉴定，若能扩增出一条290bp的条带，判定为野生型；若能扩增出一条268bp的条带，判定为MSTN基因敲除的纯合型；若能同时扩增出290bp和268bp两条条带，判定为杂合型。