[发明专利]用于MSTN基因敲除猪鉴定的功能核酸快速PCR方法与试剂盒

说明书

本发明属于转基因生物材料中转基因成分检测领域，涉及用于MSTN基因敲除猪鉴定的功能核酸快速PCR方法与试剂盒。根据基因敲除位点设计特异引物，针对不同等位基因扩增出不同的特异性片段，实现对MSTN基因敲除猪的检测。PCR引物组合1序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，得到SEQ ID NO:1所述扩增片段；引物组合2如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:4所示，得到SEQ ID NO:2所述扩增片段。当扩增产物只有一条290bp条带判定为野生型，只有一条268bp条带判定为MSTN基因敲除纯合型，同时含268bp和290bp条带判定为MSTN基因敲除杂合型。还公开了试剂盒配置及其应用。

技术领域

本发明属于转基因生物材料中转基因成分的检测技术领域，具体涉及用于MSTN基因敲除猪鉴定的功能核酸快速PCR方法与试剂盒。

背景技术

随着转基因新品种的不断形成，转入外源基因的转基因生物一直受到社会质疑，使得转基因生物的推广工作困难重重。为了消除消费者对外源基因抵触的心理，目前转基因生物的研制方向已转向内源基因敲除的研究，基因敲除是通过使目的基因失活，从而实现对基因组的精确修饰。而对基因敲除动物进行鉴定并建立便捷的检测方法是当前的趋势。

MSTN(Myostatin)基因(GenBank登录号：NM_214435)即肌肉生长抑制素基因，也叫生长分化因子(Growth differentiation factor 8)基因，能够通过调控成肌细胞进而抑制肌肉生长。动物MSTN基因的缺失或者失活可以正向调控肌细胞数量、肌纤维的直径和数量，表现为双肌性状(Marraffini LA,Sontheimer EJ.CRISPR interference limitshorizontal gene transfer in staphy-lococci by targeting DNA[J].science,2008,322(5909):1843-1845.)。而利用基因编辑技术对猪的MSTN基因进行敲除，有益于提高猪的生长速度和瘦肉率，对养猪业的发展具有重要的研究意义和应用前景。而功能核酸是用来检测的核酸分子。

目前针对基因敲除生物的检测方法有T7EⅠ核酸内切酶法、Surveyor核酸内切酶法以及DNA测序法。T7EⅠ和Surveyor核酸内切酶法能够检测出基因敲除生物全基因组存在的脱靶位点，但是对于基因敲除结果的检测效率不高，特别是对于单个或者少数碱基发生敲除的情况不能有效的检出。DNA测序方法在基因敲除检测中是首选方法，也是公认的金标准方法，但是实验成本高。因此，如何有效、准确、快速地检测出是否为基因敲除动物，并建立一种简单易行的检测方法已经成为目前的研究焦点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测MSTN基因(GenBank登录号：NM_214435)敲除猪的PCR引物与试剂盒。

本发明根据基因敲除位点设计特异引物，针对不同的等位基因扩增出不同的特异性片段，从而实现对MSTN基因敲除猪的检测与鉴定。所述的PCR引物分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示(扩增的片如SEQ ID NO:1所示)，以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5(扩增的片段如SEQ ID NO:2所示)。

本发明的试剂盒包括MSTN基因敲除猪的PCR引物、反应试剂以及阳性对照DNA模板、阴性对照DNA模板和双蒸水。利用PCR扩增，可判定是否是MSTN基因敲除猪，野生型猪或MSTN基因敲除杂合型猪。

本发明的试剂盒还可用于猪MSTN基因分型方面。

具体地，本发明采用以下技术方案：