[发明专利]一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法

权利要求书

1.一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)进行基因组DNA片段化处理及纯化；

(2)在步骤(1)后直接加入复合物[S9.6]/Protein A，实现DNA/RNA杂合链的捕获；

(3)在步骤(2)后直接加入酶和缓冲液组分，实现末端修饰；

(4)在步骤(3)后直接进行变性，变性条件为95℃下10min，变性后立即置冰上；

(5)在步骤(4)后直接加入3'接头、酶和缓冲液，实现3'接头连接；

(6)在步骤(5)后直接加入5'接头、酶和缓冲液，实现5'接头连接；

(7)在步骤(6)后直接加入扩增体系，进行文库的放大；

(8)在步骤(7)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。

2.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，其特征在于所述的片段化方式包括物理法，如超声和酶法，基因组DNA片段化成200-500bp，片段化的DNA加入磁珠进行纯化。

3.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，其特征在于所述的DNA来源包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织(FFPE)、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液、外泌体以及其它体液，同时可用于其它动物物种、植物、细菌以及病毒。

4.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，其特征在于所述的缓冲液包括：5～500mM Tris-HCl(pH7.0～9.0)、5～500mM NaCl、1～100mMEDTA。

5.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，其特征在于所述的步骤(5)中的3'接头包含连接引物和固定引物，连接引物为测序引物，连接引物碱基需修饰，所述的碱基修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3Spacer修饰；固定引物5'端为测序引物序列，3'端为序列特异性引物序列，固定引物序列碱基需修饰，修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3 Spacer修饰，所述的序列特异性引物序列包括基因特异性引物、随机引物，如NNNNNN，N＝A或C或G或T，多聚物寡核酸，如oligo dT，其中基因特异性引物长度为15-60bp，随机引物长度为3-20bp，多聚物寡核酸长度为10-60bp。

6.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，其特征在于所述的步骤(6)中的5'接头包含连接引物和固定引物，连接引物为测序引物，固定引物5'端为测序引物序列，3'端为序列特异性引物序列，序列特异性引物序列包括基因特异性引物、随机引物，如NNNNNN，N＝A或C或G或T，多聚物寡核酸，如oligod，基因特异性引物长度为15-60bp，随机引物长度为3-20bp，多聚物寡核酸长度为10-60bp，固定引物序列碱基需修饰，修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3 Spacer修饰。

7.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，其特征在于所述的上机文库适用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。