[发明专利]一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法在审

申请号：	201810423697.1	申请日：	2018-05-06
公开（公告）号：	CN108588176A	公开（公告）日：	2018-09-28
发明（设计）人：	唐琼;沈欢;陆利;秦闯华;鞠魏;唐薇;朱虎;徐根明;潘艺;赵谦	申请（专利权）人：	湖南大地同年生物科技有限公司
主分类号：	C12Q1/6804	分类号：	C12Q1/6804;C12N15/10;C40B50/06
代理公司：	暂无信息	代理人：	暂无信息
地址：	410205 湖南省长***	国省代码：	湖南;43
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摘要：
搜索关键词：	单链DNA 高通量测序文库构建建库捕获生物技术领域抗体特异性插入片段可重复测序杂合灵敏
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【说明书】：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于单链DNA构建R‑loop高通量测序文库的方法。本发明通过利用抗体特异性的对DNA/RNA杂合链进行捕获，随即进行单链DNA建库，目的是解决R‑loop测序建库过程中插入片段长度、R‑loop捕获、加接头等问题，具有精准、高效、高通量、灵敏、可重复、操作简单等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法。

背景技术

RNA可与其基因组模板共转录，或转录后产生RNA-DNA杂合体和置换的单链DNA形成三链结构，这些不寻常的核酸结构被称为R-loop。研究表明，R-loop被认为在几种人类疾病如癌症和神经退行性综合征中起作用。文献报道，肿瘤抑制因子BRCA2经常在癌症，特别是乳腺癌中突变和失活，而BRCA2表达量下调被证明会导致R-loop积累，说明R-loop与癌症发生与转移有密不可分的关系；R-loop被证实与人类智力迟钝－脆弱X综合征相关。总之，随着越来越多的研究表明R-loop表达量与各癌症等人类疾病密切相关，借助测序技术破译R-loop与疾病机理之间的相互联系已成为研究热点。

目前，全基因组中R-Loop检测方法存在严重的技术缺陷，测序数据质量不佳，易出现假阳性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，通过利用抗体特异性的对DNA/RNA杂合链进行捕获，随即进行单链DNA建库，目的是解决R-loop测序建库过程中插入片段长度、R-loop捕获、加接头等问题，具有精准、高效、高通量、灵敏、可重复、操作简单等优点。

本发明的基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法，按照以下步骤进行：

(1)进行基因组DNA片段化处理及纯化；

(2)在步骤(1)后直接加入复合物[S9.6]/Protein A，实现DNA/RNA杂合链的捕获；

(3)在步骤(2)后直接加入酶和缓冲液组分，实现末端修饰；

(4)在步骤(3)后直接进行变性，变性条件为95℃下10min，变性后立即置冰上；

(5)在步骤(4)后直接加入3'接头、酶和缓冲液，实现3'接头连接；

(6)在步骤(5)后直接加入5'接头、酶和缓冲液，实现5'接头连接；

(7)在步骤(6)后直接加入扩增体系，进行文库的放大；

(8)在步骤(7)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。

其中，所述的片段化方式包括物理法，如超声和酶法，基因组DNA片段化成200-500bp，片段化的DNA加入磁珠进行纯化。

所述的DNA来源包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织(FFPE)、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液、外泌体以及其它体液，同时可用于其它动物物种、植物、细菌以及病毒。

所述的缓冲液包括：5～500mM Tris-HCl(pH7.0～9.0)、5～500mM NaCl、1～100mMEDTA。