[发明专利]用于检测KRAS突变的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测KRAS突变的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应用。所述组合产品包括检测不同KRAS基因第2外显子突变型的LNA荧光探针以及引物；所述引物对的正向引物序列中至少存在一个锁核酸；和/或；所述LNA荧光探针序列中至少存在一个锁核酸。本发明所提供的引物对和探针组合产品具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、检测成本低、时间短、检测效率高、准确性高、假阳性低等优点。本发明试剂盒能检测KRAS基因突变类型，并能够为KRAS突变癌症的临床诊断和治疗提供指导，有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测KRAS突变的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

分子靶向治疗是癌治疗研究领域的热点之一，表皮生长因子受体抑制剂是靶向治疗药物中的一类。研究表明，人类KRAS基因的突变状态与表皮生长因子受体抑制剂的疗效存在明显相关性。

循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是新型肿瘤分子标志物，具有较高的检出率、特异性以及与组织检测结果较高一致性等特点。通过ctDNA可以实现非侵入的方式对肿瘤进行检测，有助于临床上对肿瘤组织KRAS基因突变状态进行判断。但是由于血浆中的循环游离DNA含量少，而其中的ctDNA含量更是少之又少，很多患者的ctDNA含量只占全部血液中游离的DNA片段(cell-free DNA，cfDNA)含量的0.01％～1％，因此常规的基因突变检测方法难以满足需要。

目前用于检测临床血清标本中ctDNA的方法主要以PCR扩增为主。目标基因通过PCR扩增，与分子信标相互识别，但由于现有的分子信标本质是一段DNA序列，它易被核酸酶分解且易与单链DNA结合蛋白(Single-stranded DNA-binding protein，SSB或SSBP)非特异性结合。因此，使用者迫切需要一种高灵敏度的分子信标。锁核酸(locked nucleicacid，LNA)是一种新型的双环状寡核苷酸衍生物，与DNA和RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，且遵循碱基配对原则，具有很强的亲合力，热稳定性及抗酶切能力，水溶性好且体内无毒性作用。锁核酸修饰分子信标(locked nucleic acid molecular beacon，LNA-MB)能较好的弥补分子信标的缺点。然而现有技术中并没有关于KRAS基因突变的LNA-MB检测方法。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明人经过创造性的劳动和大量的试验，得到了能够用于检测不同KRAS基因突变类型的引物对和探针，所述引物对和探针特异性强、灵敏度高，将其用于KRAS基因突变类型检测时操作简单。由此提供了下述发明。

本发明的一个方面涉及一种引物对和探针的组合产品，包括检测不同KRAS基因第2外显子突变型的LNA荧光探针以及引物；

所述LNA荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述引物选自下列引物对中的一对或多对：

其中，所述引物对的正向引物序列中至少存在一个锁核酸；

和/或；

所述LNA荧光探针序列中至少存在一个锁核酸。

本发明的另一方面还涉及一种组合物，其含有如上所述的引物对和探针的组合产品。

本发明的另一方面还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对和探针的组合产品，优选还包括荧光定量PCR反应缓冲液、样品处理液、无核酸水、DNA聚合酶、KRAS基因第2外显子突变类型阳性对照序列以及野生型对照序列中的一种或多种。