[发明专利]检测眼部微量生物样本中CMV感染的试剂盒和方法

说明书

本发明“用于检测眼部微量生物样本中CMV感染的试剂盒和方法”，涉及眼部病毒感染的分子检测技术，特别是一种微量生物样本DNA的提取方法，所述微量生物样本指体积不超过10ul‑200ul的液体样本或体积不超过1mm3的固体类样本。提取的DNA作为PCR检测模版，能够检测到眼部病毒感染情况，准确性达到80％以上，为后续采取合适的治疗手段提供可靠依据，减少治疗手段的盲目性。

技术领域

本发明涉及病毒感染的分子检测技术，特别是检测眼部微量生物样本中CMV感染的试剂盒和方法。

技术背景

由于眼部结构复杂，且受血脑屏障影响，眼部组织标本的很多检测指标与血液的检测指标相关性很低，大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因；另一方面，眼部标本体积微小，标本种类多种多样，包括各种组织、各种体液(玻璃体、房水、泪液等)、各种膜类(视网膜、角膜内皮等)、多部位分泌物等，眼部液体类样本中病毒DNA含量极低，而固体样本中病毒DNA难以提出，且样本内容物及其复杂，同时受限于取样量极小(其中固体标本一般不超过1mm³；除了泪液，眼部液体标本一般能取的量约为20-100ul，最多不超过200ul)很难满足血液、尿液检验所要求的大体积和均一种类，因此对眼部标本采用常规血液检测方法进行检测，假阴性比例非常高，常常延误治疗。目前尚未见到适合于微量标本，特别是取自眼部的微量标本的病毒检测技术。

人疱疹病毒5型CMV(Human herpesvirus 5Cytomegalovirus)，其感染十分常见,血液学检查证实60％-90％的成人都曾感染过巨细胞病毒，但通常这一感染并不引起任何临床症状。严重感染仅发生于出生前感染的婴儿和免疫系统功能受损者，如艾滋病患者和器官移植者。器官移植者易感染巨细胞病毒是由于治疗过程中为预防移植排异反应使用免疫抑制剂引起免疫功能下降，比如角膜移植术中术后常发生CMV感染导致移植失败。再如肿瘤移植病人术后，CMV感染成高发趋势，目前临床只注重于血液检测和全身给药，因对眼内检测手段的缺乏，眼内感染CMV往往被忽视，继发CMV眼内感染，导致视力丧失的病例也日趋多见

目前做眼部病毒感染的检测，依然采用血液检测，但是大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因，易漏诊误诊。

获得眼部感染的准确检测结果，是后序采取正确治疗手段的前提；但是目前尚缺乏专门针对眼部组织病毒感染的高灵敏检测手段，也未见到以眼部微量样本为标本，采用常规PCR 高灵敏度地检测病毒感染的报道。

发明内容

根据上述领域的空白，临床上急需开发一种适合于眼部微量且多样标本的病毒DNA提取方法和高灵敏度病毒检测试剂盒，鉴于此，本发明提供一种适合于眼部各类标本进行CMV病毒检测的方法、荧光探针检测试剂盒及DNA提取方法，本发明请求保护的技术方案如下：

一种微量生物样本DNA模板的制备方法，包括如下步骤：

(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶K、100-300μl裂解缓冲液AL，于56℃处理至少10分钟；所述微量生物样本指体积不超10ul-200ul的液体状样本或体积不超过1mm³的固体状样本；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm 离心0.5-2min；

如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；

(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；