[发明专利]巢式PCR快速检测胶胞炭疽菌的体系建立及应用

说明书

本发明公开了一种用于巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物及其应用，它由第一轮引物对和第二轮引物对构成，其中，第一轮引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，第一轮引物对的下游引物序列如SEQ ID No.2所示，第二轮引物对的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，第二轮引物对的下游引物序列如SEQ ID No.4所示。采用本发明提供的方法和试剂盒，可以检测特定材料是否被核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌侵染，也可以针对核桃种植区进行核桃炭疽病危害的预警，防治核桃炭疽病大面积传播造成的农业经济损失。本发明的方法及试剂盒具有快速高效，易于实现，敏感可靠等优点，可在一天内完成多个待考察地区的检测或预警。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物及应用。

背景技术

随着核桃集约栽培程度的不断提高和种植面积扩大，传统的粗放管理模式及不适宜品种的选择导致核桃病害危害日趋严重，已成为核桃产业发展面临的严峻问题，其中炭疽病是近年来危害核桃产业的主要病害，在核桃上主要危害果实，引起早期落果或核桃不成实，发病重的年份可致丰产不丰收，而且感染叶片、嫩梢，病害连片，造成叶片、嫩梢大面积坏死。核桃炭疽病的病原菌为胶胞炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.)，属半知菌亚门、腔孢纲、炭疽菌属。该病原菌在病枝、病果或土壤中越冬，翌年春季病原菌开始活动并借风、雨、昆虫传播。发病轻重与降雨密切相关，雨季早且降雨量大则病害发病早且严重，此外，水位高、株行间距小、通风透光不良也易造成病害发病严重和传播蔓延。由于该病具有潜伏侵染的特性，且具有发病时间集中、爆发性强等特点，故选择化学药剂进行防治仍是当前主要对策，但发病后再进行防治，往往对核桃产量已造成较重影响。因此亟需一种能够在发病初期进行早期快速检测的技术，为及时有效的防控措施提供指导。

传统的植物病害的诊断主要依据植株的明显病症和病原菌形态，操作难度大，耗时耗力，且此时病害往往已对植株造成危害，因此亟需快速而准确的检测技术应用于植物病害的诊断过程中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速而准确的检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的手段。

本发明的技术方案为：用于巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物，它由第一轮引物对和第二轮引物对构成，其中，第一轮引物对的上游引物序列如SEQID No.1所示，第一轮引物对的下游引物序列如SEQ ID No.2所示，第二轮引物对的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，第二轮引物对的下游引物序列如SEQ ID No.4所示。

上述所述的特异性引物在巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌上的应用。

一种巢式PCR试剂盒，含上述所述的特异性引物。

一种检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的方法，包括如下步骤：

(1)采取待测的样品，并提取总DNA；

(2)以总DNA为模板使用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物对进行第一轮PCR扩增；

(3)取第一轮PCR扩增产物为模板使用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的引物对进行第二轮PCR扩增；

(4)结果判断：检测第二轮PCR扩增产物，结果出现302bp特征条带说明所述样品具有了核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌；未出现302bp特征条带说明所述样品未具有核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌。