[发明专利]番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45及其克隆、检测与应用方法

权利要求书

1.一种番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45的克隆方法，其特征在于，以EcircRNA45-C-FP、EcircRNA45-C-RP和EcircRNA45-D-FP、EcircRNA45-D-RP为特异性引物，其中，EcircRNA45-C-FP和EcircRNA45-C-RP所示的DNA序列组成正向引物对，EcircRNA45-D-FP和EcircRNA45-D-RP所示的DNA序列组成反向引物对；

所述的特异性引物EcircRNA45-C-FP、EcircRNA45-C-RP、EcircRNA45-D-FP和EcircRNA45-D-RP序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。

3.根据权利要求2所述番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45的克隆方法，其特征在于，以番茄L3708的gDNA和cDNA为模板，分别以EcircRNA45-C-FP、EcircRNA45-C-RP、EcircRNA45-D-FP和EcircRNA45-D-RP为特异性引物，进行PCR扩增，即可得到番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45。

4.权利要求1所述番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45表达量的检测方法，其特征在于，在番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45的反向剪接位点两端进行qRT-PCR的引物设计，设计的引物分别为qRT-EcircRNA45-FP和qRT-EcircRNA45-RP；

所述设计的引物qRT-EcircRNA45-FP和qRT-EcircRNA45-RP序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。

5.权利要求1所述番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45的应用方法，其特征在于，具体方法为：

S1、对番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45序列两端进行延长，最终在其序列的上游和下游引入反向剪接位点；

S2、根据新序列进行引物设计并在引物两端分别添加Bam H I和Sac I酶切位点与保护碱基后得到最终引物，所述最终引物为EcircRNA45-FP和EcircRNA45-RP；

EcircRNA45-FP序列如SEQ ID NO:12所示，EcircRNA45-RP序列如SEQ ID NO:13所示；

S3、用步骤S2获得的最终引物进行番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45序列扩增并连接pBI121载体，得到最终表达载体pBI121-EcircRNA45；

S4、将步骤S3制得的最终表达载体pBI121-EcircRNA45导入根癌农杆菌GV3101感受态细胞，摇菌培养，得到pBI121-EcircRNA45过表达载体菌液；

S5、取六叶期番茄作为处理对象，以注射的方式向所述六叶期番茄叶片内导入的步骤S4制得的pBI121-EcircRNA45过表达载体菌液，进而实现番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45的过表达。