[发明专利]番茄抗晚疫病外显子环状RNA-EcircRNA45及其克隆、检测与应用方法

说明书

本发明提供了一种番茄抗晚疫病外显子环状RNA‑EcircRNA45以及该基因的克隆方法；本发明还提供了上述番茄抗晚疫病外显子环状RNA‑EcircRNA45的应用方法，用于番茄抵御病原菌侵染，即在番茄中过表达所述番茄抗晚疫病外显子环状RNA‑EcircRNA45。本发明首先设计特异的环状RNA引物进行PCR、一代测序实验证实番茄抗晚疫病外显子环状RNA‑EcircRNA45的客观存在；还提供了一种有效检测番茄抗晚疫病外显子环状RNA‑EcircRNA45的特异qRT‑PCR引物，减少了假阳性的存在。藉由本发明外显子环状RNA‑EcircRNA45的过表达，可以实现对番茄晚疫病抗性基因的调控。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种番茄抗晚疫病外显子circRNA45及其克隆方法与应用方法。

背景技术

番茄是一种世界范围内广泛种植的园艺作物并且是双子叶模式茄科植物。由晚疫病菌侵染所造成的晚疫病在世界范围内对番茄生产造成了巨大的经济损失。虽然化学农药的使用能减缓疾病的发生和蔓延，但随之而来的农药残留、环境污染、病原菌抗药性等问题日益严峻。虽然存在针对晚疫病菌抗性基因研究出的适宜栽培种，但晚疫病菌毒力结构复杂，已知的番茄抗病基因容易丧失抗性，因此寻找新的抵御病原菌侵染途径迫在眉睫。

环状RNA(ciucularRNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的非编码RNA 家族新成员，是以共价键化合形成环状结构的内源性RNA分子。1976年Sanger 团队提出高等植物中的类病毒为一种单链环状闭合的RNA病毒，并将这种RNA 称为环状RNA，由此环状RNA的概念第一次被提出(Sang et al.,1976)。另外在 1991年Nigro等发现人类的促癌基因存在显著的反式剪接现象可以生成 circRNA产物(Nigro et al.,1991)。尽管circRNA在许多物种中保守存在，但以前一直被视为错误剪接产物而不被重视(Qian et al.,1992)。并且由于技术的限制， circRNA的研究一直处于比较低迷的状态。

近年来随着测序技术的进步，使得circRNA的研究成为可能。2012年首次证实在人体细胞的基因表达程序中发现circRNA分子的存在比线性RNA更普遍 (Salzman et al.,2012)。随着时间的发展，利用高通量测序技术又分别在人、小鼠和线虫中证实了1950、1903、724个circRNA的存在(Memczak et al.,2013)。另外circRNA常常在体内表现为组织或者发育阶段特异性(Szabo et al.,2015)。近几年研究发现circRNA能够吸附miRNA从而存在相应的生物学功能，这一功能使得circRNA引起了研究者的广泛重视(Hansen et al.,2013)。

CircRNA主要通过非典型可变剪切加工产生，目前发现的circRNA主要来源于基因外显子，但多项研究表明circRNA的类型比想象的要复杂，根据组成不同，circRNA可分为外显子circRNA(Exon circular RNAs,EcircRNA)，内含子 circRNA(Intron circular RNAs,IcircRNA)及外显子-内含子circRNA(Exon-intron circular RNAs,EIcircRNA)，研究发现最多的是EcircRNA。目前环状RNA的鉴定主要是先确定环状RNA的反向剪接位，需要跨反向剪接位点设计引物进行 PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序，如果所扩增的序列中含有反向剪接序列，则证明此序列为circRNA。但该方法的主要关键点是要确定circRNA的准确环化位置，然后才能设计引物。而数据分析得到的反向剪接位点通常范围较广，因此如何选择合适的剪接位点变得很重要。