[发明专利]一种用于检测布氏菌的荧光定量重组酶聚合酶扩增方法

说明书

本发明提供通用型布氏菌的荧光定量RPA快速检测方法，本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：20min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为10个拷贝；2)特异性强：采用PRA引物组和荧光探针特异性对布氏菌进行检测，与常见非布氏菌株无交叉反应；3)操作简便：配置好的RPA反应体系，设置好反应程序，置于荧光定量PCR仪或RPA反应仪中。4)高通量：可一次性进行大量样品检测，结果判定与统计由程序自动完成。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)进行布氏菌荧光定量快速检测方法。

背景技术

布氏菌病(简称布病)是由布氏菌引起的人兽共患病，近年来该病在我国呈扩散趋势，给畜牧业造成了重大损失并严重威胁公共卫生安全。布氏菌可感染猪、牛、羊、犬、鼠等多种哺乳动物，其中对公共卫生和畜牧业影响严重的为牛种布氏菌、羊种布氏菌、猪种布氏菌、绵羊附睾种布氏菌、犬种布氏菌和沙林鼠种布氏菌6种经典种型。布氏菌病主要危害动物的生产性能，公畜出现睾丸炎、附睾炎、精囊坏死等症状，患病母畜出现胎盘炎、乳房炎、流产、不孕不育等症状。人类由于接触布氏菌污染的环境、患病动物分泌物、尸体及产品而感染发病，患者病情反复不易彻底治愈，出现乏力、发热、盗汗、关节酸痛等症状，严重者丧失劳动能力。因此，实现布氏菌的快速检测，对该病的诊断、防控及净化具有重要意义，从而降低该病造成的损失以及公共卫生风险。

RPA是近年新开发的恒温核酸扩增技术，该技术在36～40℃恒温条件下，通过重组酶、聚合酶和单链DNA结合蛋白的作用，在20min内实现目的基因的大量扩增，具有特异性强、灵敏度高、反应速度快、操作简便等优点，并且反应仪器简单便携。根据反应原理和使用探针的差异，RPA分为普通RPA、exo-RPA、nfo-RPA和fpg-RPA，反应结果可通过琼脂糖凝胶电泳、荧光定量扩增曲线和LFD测流层析试纸条进行判定，因此在设计RPA检测方法时应根据需求设计相应的引物和探针。exo-RPA、nfo-RPA和fpg-RPA方法都可以通过荧光定量扩增曲线法判定结果，可实现样品的快速高通量检测，适用于检验检疫和流行病学调查；此外，nfo-RPA方法还可通过LFD试纸条读取检测结果，适用于野外及现场快速检测。

洪彬等申请了一种用于现场快速检测布鲁氏菌的通用RPA方法及其配套试剂盒(申请号201510293311.6)，该方法采用LFD测流层析试纸检测试验结果，反应完成后人工观察并判定检测结果。Hang Ren等(Ren，Y.Z.,et al.,Development of a rapidrecombinase polymerase amplification assay for detection of Brucella in bloodsamples.Molecular and Cellular Probes,2016.20:p.122.)公开了一种基于RPA方法建立的用于检测血液样品中布氏菌的荧光定量RPA方法。该方法扩增并检测的目的基因为Omp31蛋白编码基因，但该基因已经被证实在牛种布氏菌基因组中缺失，因此该方法不适用于牛种布氏菌的检测。

发明内容

本发明的目的是提供通用型布氏菌的荧光定量RPA快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供用于检测布氏菌的荧光定量RPA引物组和荧光探针，引物和探针信息如下：

BCSP 31-F:5'-TGCATCCCGGCGCAGAACGCTTTTACAAGGAA-3'、

BCSP 31-R:5'-ATAACGAGCTGCCGCAATGTCACCCTTCAATT-3'、

BCSP 31-Probe:5'-GCGGGCGTGCTGAAATAATCCCTCAAT

GA-FAM-dT-THF-GG-BHQ1-dTTCCTGATATCTTA-dSpacer-3'