[发明专利]一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法

权利要求书

1.一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法，其特征在于：它包括以下步骤：

1）选择原材料：采用自然授粉结实、成熟、未开裂的铁皮石斛蒴果；

2）材料消毒：对成熟未开裂蒴果进行消毒处理；

3）接种：将消毒处理后的蒴果在无菌条件下，用镊子夹紧果柄一端，用刀具将蒴果另一端切一小口，轻轻抖动，将种子均匀撒布在诱导种子萌发培养基上，立即盖上瓶盖，放在培养室进行培养；

4）铁皮石斛原球茎的选择：选择由铁皮石斛种子诱导出的生长状态良好、无分化、色泽鲜绿的原球茎为材料，在工作台里接种，接种原球茎直径在0.2～0.4cm，质量2～5g为宜；

5）采用石斛原球茎液体静止悬浮培养，其培养基配方为：B5培养基+0.4～1.0g/L萘乙酸+50～150g/L土豆+10～20g/L蔗糖，pH值5.5～5.8；基本培养条件：温度20～30℃,光照12～15h/d，光照强度为4000lx～4500lx，悬浮培养过程中使用200mL的三角烧瓶或玻璃培养瓶作为培养容器。

2.根据权利要求1所述的一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法，其特征在于：在步骤2）中，所述对成熟未开裂蒴果进行消毒处理方法为：成熟未开裂蒴果→自来水冲洗→ 75％酒精浸泡1min→0.1％升汞溶液浸泡15min→无菌水冲洗4次→无菌滤纸吸干后备用。

3.根据权利要求1所述的一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法，其特征在于：在步骤3）中，所述诱导种子萌发培养基及培养条件为：以MS基本培养基，附加琼脂0.68％，6-苄基氨基嘌呤0.4～0.6mg/L、萘乙酸0.1～0.4mg/L、土豆80～100g/L、吲哚丁酸0.2～0.5mg/L、蔗糖20～30g/L；培养基pH值5.4～5.8；培养条件：温度25～28℃，光照12h/d，光照强度2000lx。

4.根据权利要求1所述的一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法，其特征在于：在步骤5）中，具体培养过程包括以下步骤：

a.配制B5基础培养基母液，其中大量元素A为20倍浓缩；微量元素B为1000倍浓缩；铁盐C为100倍浓缩；有机D为1000倍浓缩；肌醇为500倍浓缩；

b.以配制5L为列，选择5L的量筒，先加入1L的水，然后依次按比例加入0.4～1.0g/L萘乙酸、50～150g/L土豆和10～20g/L蔗糖；

c.加入土豆汁，土豆清洗后去皮，按配方称取需要量，榨汁后过滤，去掉土豆渣及上层白沫；

d.加完培养基成分后，加入去离子水，定容到5L，然后调PH值；

e.按配方量装瓶，封口后放入灭菌锅，121℃高温高压湿热灭菌20～25min；

f.取出培养基，放入干净、相对无菌的接种室，放置5～7天，待培养基无染菌现象后接种；

g.在工作台里接种，培养基放入工作台前，用75％酒精雾喷消毒；

h.把挑选好的铁皮石斛原球茎，用灭过菌的镊子夹碎成适当大小，转接入液体悬浮培养基中，接种量为1～3g；

i.封口，暗处理1～3天后，放入光照培养室培养。