[发明专利]一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法

说明书

本发明公开了一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法，它包括选择原材料、材料消毒、接种、铁皮石斛原球茎的选择及采用石斛原球茎液体静止悬浮培养等步骤。本发明的液体静止悬浮快速培养方法，可使铁皮石斛原球茎高效、高质、低成本快速扩繁，为石斛苗组培提供充足的石斛球茎种源，满足市场对铁皮石斛的巨大需求；在整个培养过程中无需摇床震荡培养，在设备投入和能耗上节约了大量资本，有力推动了石斛组培及石斛相关产业的发展。

技术领域

本发明涉及植物组培技术领域，特别是涉及一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法。

背景技术

目前，对石斛组织培养技术的研究与报道很多，其方法也多种多样。组织培养获取再生植株的方式主要有以下几种：种子→原球茎→小植株；种子→原球茎→愈伤组 织→丛芽→生根苗；种子→原球茎→无菌苗茎段→小植株；种子→愈伤组织→原球茎→小植株；原球茎→人工种子→幼苗；茎尖→愈伤组织→丛芽→生根苗等。但许多组培企业大都采用固体培养基培养铁皮石斛原球茎，其中主要凝固成分为琼脂，市面上琼脂价格在每克120元左右，造成生产成本上升；其次固体培养基接种速度慢，造成人力成本上升，且固体培养基增殖石斛原球茎，增殖量小、周期长，一直是制约石斛组培企业及整个石斛产业链发展的瓶颈。

现有的铁皮石解原球茎增殖的液体悬浮培养体系中，其技术方法为：首先在添加0.5mg/LABA的1/4MS培养基里预培养30d，然后转入1/4MS+40mg/LVc液体培养基，pH5.6，摇床转速为50r/min，每15d继代一次，黑暗培养。原球茎的质量提高、同步性好。但现有的铁皮石解原球茎增殖的液体悬浮培养体系需要摇床震荡培养，这不仅增加了生产设备的投入，而且 增加了能耗、增加了生产环节，从而使生产成本上升，阻碍了液体悬浮培养这一技术的应用及工业化发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法，以便在整个石斛原球茎液体悬浮培养过程中，无需摇床震荡，完全静止培养，使铁皮石斛原球茎液体悬浮培养技术真正能走向产业化生产。

本发明解决技术问题的方案是：一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法，它包括以下步骤：

1）选择原材料：采用自然授粉结实、成熟、未开裂的铁皮石斛蒴果；

2）材料消毒：对成熟未开裂蒴果进行消毒处理；

3）接种：将消毒处理后的蒴果在无菌条件下，用镊子夹紧果柄一端，用刀具将蒴果另一端切一小口，轻轻抖动，将种子均匀撒布在诱导种子萌发培养基上，立即盖上瓶盖，放在培养室进行培养；

4）铁皮石斛原球茎的选择：选择由铁皮石斛种子诱导出的生长状态良好、无分化、色泽鲜绿的原球茎为材料，在工作台里接种，接种原球茎直径在0.2～0.4cm，质量2～5g为宜；

5）采用石斛原球茎液体静止悬浮培养，其培养基配方为：B5培养基+0.4～1.0g/L萘乙酸+50～150g/L土豆+10～20g/L蔗糖，pH值5.5～5.8；基本培养条件：温度20～30℃,光照12～15h/d，光照强度为4000lx～4500lx，悬浮培养过程中使用200mL的三角烧瓶或玻璃培养瓶作为培养容器。

在步骤2）中，所述对成熟未开裂蒴果进行消毒处理方法为：成熟未开裂蒴果→自来水冲洗→ 75％酒精浸泡1min→0.1％升汞溶液浸泡15min→无菌水冲洗4次→无菌滤纸吸干后备用。

在步骤3）中，所述诱导种子萌发培养基及培养条件为：以MS基本培养基，附加琼脂0.68％，6-苄基氨基嘌呤0.4～0.6mg/L、萘乙酸0.1～0.4mg/L、土豆80～100g/L、吲哚丁酸0.2～0.5mg/L、蔗糖20～30g/L；培养基pH值5.4～5.8；培养条件：温度25～28℃，光照12h/d，光照强度2000lx。

在步骤5）中，具体培养过程包括以下步骤：