[发明专利]一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法

权利要求书

1.一种高通量对目标片段DNA多位点引入突变的方法，包括如下步骤：

(1)根据目标片段DNA的序列，针对每个预突变位点及其对应的预突变结果分别设计单链寡核苷酸片段；

所述单链寡核苷酸片段自5’端到3’端依次由上游接头序列、内切酶M的正向识别序列、突变引物、所述内切酶M的反向识别序列和下游接头序列组成；所述突变引物由对应于所述预突变位点的突变序列和位于所述目标片段DNA上所述预突变位点两侧的同源序列组成；

(2)合成步骤(1)所设计的单链寡核苷酸片段，获得包含所述突变引物序列的混合ssDNA文库；

(3)以步骤(2)所得的混合ssDNA文库为模板，采用所述上游接头序列和所述下游接头序列作为引物对进行PCR扩增，然后采用所述内切酶M对所得PCR产物进行酶切处理，获得短双链突变引物文库；

(4)利用所述目标片段DNA的全长上游引物和步骤(3)获得的短双链突变引物文库对所述目标片段DNA进行首轮TouchDown PCR，扩增20-25个循环后得到一组产物，记为产物A；利用所述目标片段DNA的全长下游引物和步骤(3)获得的短双链突变引物文库对所述目标片段DNA进行首轮TouchDown PCR，扩增20-25个循环后得到另一组产物，记为产物B；将所述产物A和所述产物B混合后继续进行5-10个循环的第二轮TouchDown PCR，得到终产物；所述终产物中的DNA片段与所述目标片段DNA相比已被引入多位点突变；

步骤(1)中，还包括按照如下在所述突变引物内部排除所述内切酶M的识别序列的步骤：将存在所述内切酶M的识别序列的所述突变引物的序列在所述内切酶M的识别序列处进行同义氨基酸替换；

所述内切酶M为BspQI。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，根据步骤(1)所设计的单链寡核苷酸片段的序列，利用DNA合成仪合成单链寡核苷酸片段并固定在用于制备芯片的固相载体上，合成结束后，将所述单链寡核苷酸片段从所述固相载体上脱离下来，获得包含所述突变引物序列的混合ssDNA文库。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，每个所述预突变位点为1个氨基酸的点突变或者为2-5个连续的氨基酸突变。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述突变引物中的所述突变序列为3-15nt，两侧的所述同源序列为15-21nt。

5.根据权利要求1-所述的方法，其特征在于：步骤(3)中进行的所述PCR扩增为两轮PCR扩增；

第一轮PCR扩增：以所述混合ssDNA文库为模板，采用所述上游接头序列和所述下游接头序列作为引物对，进行10个循环的PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；

第二轮PCR扩增：将所述第一轮PCR扩增产物稀释5-10倍后作为模板，采用所述上游接头序列和所述下游接头序列作为引物对，再进行10个循环的PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述全长上游引物和所述全长下游引物在各自的首轮TouchDown PCR反应体系中的终浓度均为0.5-1μM；所述短双链突变引物文库在首轮TouchDown PCR反应体系中的终浓度大于等于0.05-0.1μM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述TouchDown PCR的退火温度由65℃以0.3℃/循环的速度递减。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法在步骤(4)之后，还包括如下步骤(5)；

(5)将所述终产物组装入高拷贝数质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，根据文库大小进行突变体建库，对构建好的文库进行功能表型筛选；然后抽提质粒，扩增靶标片段并进行高通量测序分析。