[发明专利]一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法

说明书

本发明公开了一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法。本发明所提供的方法是基于重叠延伸PCR高通量对目标基因片段多位点高效引入突变的方法；所用引物不是简并引物，而是准确设计目标突变序列的突变引物；突变位点长度不限于单个氨基酸，可设计为连续1‑5个氨基酸；引物非单条分开合成，而是由寡核苷酸合成仪在集成芯片上批量合成，引物种类量级可达10⁴‑10⁵种类/批次；本发明所述突变方法可通过调节反应条件在一定程度上实现对突变频率的控制。本发明的突变建库方法可获得较高比例的有效突变体，建库突变体阳性率(非同义氨基酸突变)可达～80％；本发明所建的突变体库经过后续高通量筛选成为获得理想蛋白质及核酸改造体的有力工具。

技术领域

本发明涉及基因操作技术领域，特别涉及一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法，具体是一种基于重叠延伸PCR，使用精确设计的寡核苷酸芯片高通量合成的突变引物文库，向目标基因片段多位点同时引入突变的方法。

背景技术

1967年Spiegelman等提出在体外分子水平定向进化生物分子的思想，定向进化技术是一种利用实验室手段通过反复多次改造遗传多样性，结合高通量文库筛选从而获得理想性状生物体的过程，现已成为蛋白质工程领域应用最广泛、最有效的技术之一。定向进化属于蛋白质的非合理设计范畴，与理性突变方法相比，突变体的构建无需受蛋白质空间结构信息和构效关系的限制，而是在体外模拟自然进化的过程(随机突变和选择)，在基因内部引入大量变异，并通过筛选实现在较短时间内定向选择出所需性质或功能的基因突变体。

早期的定向进化技术的目标多是单个蛋白，基本用于蛋白质的研究和开发：通过随机或定点引入突变，以获得目的蛋白产量提高、蛋白催化活性提高或稳定性增强等突变体以满足生物催化及生物医药等领域的工业化需求。而近年来的趋势则转向于对整个代谢途径甚至在基因组水平进行改造，为有效合成有价值的生物产品构建新型的全细胞催化体系。

易错PCR是应用最早、最成熟也是目前最常用的一项定向进化技术。其原理是在体外扩增基因时适当地调整PCR实验条件，使扩增过程层出现少量碱基错配而引入突变的诱变方法。可调整的条件如使用低保真度的Taq酶，采用突变酶，调整反应体系中4种dNTP比例，增加Mg²⁺浓度，加入Mn²⁺等。也可以组合多个条件以提高碱基错配的机率。该方法的优点是：易错PCR操作简单，无需额外合成特殊引物，且PCR过程中并未改变目标片段扩增长度，突变频率可在一定程度上通过调节反应条件进行相应的控制，另外，迭代易错PCR可使小的有益突变累积而获得较为理想的突变体。不足之处是：(1)易错PCR一般只会引入很小部分序列改变(以点突变为主)，因而一般适用于较小的基因片段(＜2kb)。(2)引入突变的随机性导致的大量同义突变、终止密码子突变及读码框破坏等大量的冗余突变使得易错PCR构建的突变文库有效率较低，有效突变体比例约占0.1-0.2％，增加了实验成本，造成了下游筛选实验的困难，难以获得理想突变体。

1982年，加拿大著名科学家Smith等发明了寡聚核苷酸定点突变技术，为蛋白质工程领域的发展奠定了重要的基础。定点突变作为一种最基本的理性设计方案至今仍被广泛应用于各种蛋白质改造。然而定点突变技术面临的最重要的难题是如何从其它19种天然氨基酸中选出可以达到改造蛋白目标的最佳替换氨基酸。一系列研究表明，多点突变能获得比起单点突变有更高概率获得更理想的进化子，然而多点突变是定点突变不易直接获得的。针对这类问题，基于PCR的点饱和突变技术的开发由于其简单快速及易操作性而受到了广大研究者的青睐。

基于PCR的点饱和突变方法的基本原理是在靶点处设计简并引物对目的基因进行扩增以达到获取突变子的目的。简并引物的突变位点一般计为NNN或NNX(N代表4种核苷酸等比例混合物；X代表2种核苷酸等比例混合物(如G/C或G/T)，同一位点的各种核苷酸替换不存在偏好性。基于PCR的点饱和突变方法主要分为以下两种：