[发明专利]7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用

说明书

本发明公开了一种通过蛋白质工程获得的辅酶偏好性改变的7β‑羟基甾醇脱氢酶突变体、其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组突变体酶制剂的制备方法，以及该重组突变体酶制剂在制备熊脱氧胆酸中的应用。通过酶法耦联的辅酶再生，本发明所述重组突变体酶制剂可以高效利用相对廉价的氧化型辅酶I(NAD⁺)而非昂贵的氧化型辅酶II(NADP⁺)，催化7‑羰基石胆酸的不对称还原，有效降低了生产成本，并且具有操作简单、反应条件温和、环境友好，产率高等优势，在鹅脱氧胆酸差向异构制备熊脱氧胆酸中具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种辅酶偏好性改变的7β-羟基甾醇脱氢酶突变体、其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂的制备方法，以及重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂在制备熊脱氧胆酸中的应用。

背景技术

熊脱氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid，UDCA)是名贵中药材熊胆的有效成分，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，又名乌索去氧胆酸、熊去氧胆酸，是美国FDA批准认可的治疗原发性胆汁性肝硬化的药物，还用于治疗原发性硬化性胆管炎，酒精性和脂肪性肝病、病毒性肝炎、药物性肝炎等胆汁淤积性肝病，也是胆固醇性结石溶石治疗的首选药物。1902年瑞典化学家Hammarsten首先从北极熊的胆汁中发现UDCA，1927年日本冈山大学Shoda从中国黑熊胆汁中分离、结晶得到UDCA，并对其进行了命名，1954年Kanazawa通过化学法合成UDCA并开始应用于临床(Journal of Biotechnology,2014,191:11-21)。

UDCA在熊的胆汁中含量最高，而在其他动物的胆汁中含量很少。目前，UDCA主要从熊胆中提取，少量由人工合成。“活熊取胆”是从人工养殖黑熊活体中提取UDCA的方法，这种方法产率低，周期长，并且因违背自然伦理而一直受到争议。从二十世纪五十年代开始，就有化学法合成UDCA的报道，随着生物技术的发展，利用生物催化技术及与化学法结合的方法合成UDCA由于具有反应条件温和、选择性高、绿色环保等优点，得到极大关注。采用养殖的家禽、家畜胆汁中可大量获取的胆酸(CA)或者鹅脱氧胆酸(CDCA)作为底物，采用酶法或者化学-酶法结合的方法，人工合成具有较高价值的UDCA，减少对天然熊胆汁的需求，符合当代可持续发展的理念，具有重要的经济、社会价值和生态意义。

当前工业上采用传统的七步合成法生产UDCA，以牛、羊胆汁中的胆酸(CA)为原料，酸性条件下，羧基甲酯化，再用吡啶/冰醋酸进行3位和7位二乙酰化以保护羟基，12位羟基用氧化铬氧化，随后Wolff-Kishner-黄鸣龙还原，然后水解得到CDCA，进一步氧化生成7-羰基石胆酸(7-KLCA)，最后在正丙醇中用碱金属钠还原得到UDCA。这种方法步骤繁琐，合成路线长，反应剧烈，操作安全性差，总收率低(27％-32％)，环境污染严重，不符合当代可持续发展的理念。日本专利(JP 02282393)报道，在丁醇溶液中，氢氧化钠和钯碳存在的碱性条件下，于100℃，80kg/cm²的压力环境中，化学法催化7-KLCA的氢化反应，反应5h，UDCA的得率为88.2％。由于此方法需要在高压下反应，操作不便，没有投入实际应用。

2009年，Riva等报道了生物催化CA转化生成12-羰基熊脱氧胆酸，进而利用化学法催化还原制备UDCA的方法(Adv Synth Catal,2009,351:1303-1311)。该生物转化反应中使用了三种酶，首先应用7α-羟基甾醇脱氢酶(7α-HSDH)和12α-羟基甾醇脱氢酶(12α-HSDH)催化CA氧化生成7,12-二羰基石胆酸，再利用7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-HSDH)催化7,12-二羰基石胆酸还原生成12-羰基熊脱氧胆酸，随后通过Wolff-Kishner-黄鸣龙还原反应生成UDCA。由于该酶法氧化还原过程中催化辅酶循环再生的酶专一性差，导致转化不完全，因此终产物UDCA的纯度不高。