[发明专利]基于微流控芯片检测游离甲状腺素fT4试剂盒及制备和检测方法

权利要求书

1.一种基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)微流控芯片包被：取游离甲状腺素fT4鼠单抗Anti-Thyroxine 6901 SPTN-5 1mg，加50mM pH9.6的CB缓冲液至1mL，按照单个芯片25μL加入微流控芯片反应腔室内，温浴2小时后对芯片进行清洗；

(2)荧光微球标记：取游离甲状腺素fT4抗原Thyroxine加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；

(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱中进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；

芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并；

(4)定标品的制备：定标品由A组分和B组分构成；

根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；

定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL，2-8℃保存；

定标品B组分：用定标品稀释液将游离甲状腺素fT4抗原母液稀释至2ng/mL，2-8℃保存；

(5)得基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒。

2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述荧光微球活化处理的方法为：称取EDC使用Mes缓冲液配置成为10mg/mL的溶液，后使用Mes缓冲液进一步稀释成为1mg/mL的溶液，量取1mg羧基荧光微球，微球固型物含量为10mg/mL，体积计算为100μL，置于EP管中，加入0.45mL Mes缓冲液稀释，从1mg/mL的EDC活化剂溶液中取5μL迅速加入微球溶液中，涡旋混匀，于超声清洗器中超声10min，后置于滚轴混匀器上震荡反应20min，总反应时间为30min。

3.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述封闭液含有2％BSA、0.5％Tween-20、10％海藻糖以及0.2％甘露醇。

4.根据权利要求3所述的基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，封闭处理的方法为：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，其中第二层芯片的背面反应腔室内需要添加6μL+6μL的封闭液进行封闭，第三层正面的反应腔室内，分别需要添加5μL+5μL+5μL的封闭液进行封闭。

5.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述微流控芯片为三片式结构，包括由上到下依次层叠的上层芯片、中层芯片以及下层芯片；上层芯片、中层芯片以及下层芯片两两之间均通过定位柱、定位孔配合连接的方式实现相互间的层叠。

6.一种基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒，包括有微流控芯片，其特征在于，还包括有定标品，所述定标品由A组分和B组分构成，其中，定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL；定标品B组分为用所述定标品稀释液将游离三碘甲状腺原氨酸fT3定标品抗原母液稀释至2ng/mL；游离甲状腺素fT4抗原Thyroxine标记的荧光微球在所述微流控芯片内进行干燥处理；另一游离甲状腺素fT4鼠单抗Anti-Thyroxine 6901 SPTN-5包被在微流控芯片反应腔内。

7.一种基于微流控芯片检测游离甲状腺素fT4的方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法得到的试剂盒，包括以下步骤：

(1)移液器加样，吸取100μL的样本加入加样孔内，将微流控芯片进入检测仪器内，气路装置缓慢充气，推动样本往前移动，气体由透气口流出，液体在以PS为基材的微流控芯片内流入反应腔室内，样本接触反应舱室末端的导电橡胶，电容变化会触动，关闭流道阀门，同时关闭气路开关，停止加压；

(2)仪器开启超声装置，超声混匀3-10分钟，超声探头置于三层芯片底部，位于反应腔室的中间部分，避免直接超声对芯片内的包被抗体产生影响，反应结束后气体推动样本进行向前移动，吹干加样孔和流道样本，清洗液路装置启动，进入反应腔室内，混匀1-3分钟，进行清洗；加样口处的气体推动清洗液继续进行移动，吹干反应腔室和流道液体；

(3)开启激发光源，对免疫反应结合固定的荧光微球进行测定，仪器读取芯片反应腔室的下面部分荧光强度，获得数据后通过计算并给出相应结果报告。