[发明专利]一种用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能的方法

权利要求书

1.RcCO基因片段、含有RcCO基因片段的重组表达载体或含有RcCO基因片段的转基因工程菌在调控月季开花时间中的应用，其特征在于，将含有内源目的基因片段的TRV2病毒沉默表达载体质粒瞬时转化月季，使月季开花时间延迟；所述RcCO基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述含有RcCO基因片段的重组表达载体是TRV介导的RcCO基因病毒诱导基因沉默载体，为将所述RcCO基因片段插入到TRV2载体的Kpn I和Xho I位点之间得到；所述RcCO基因片段的转基因工程菌为将所述含有RcCO基因片段的重组表达载体转化感受态农杆菌得到。

2.一种调控月季开花时间的方法，其特征在于，将含有权利要求1所述RcCO基因片段的TRV2病毒沉默表达载体质粒瞬时转化月季，诱导月季内源目的基因发生沉默，使月季开花时间延迟。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：取月季当年生长且尚未充分木质化的枝条，去掉顶部嫩梢和基部部分，将枝条剪成带2-3个芽的茎段，上切口平剪，下切口剪成马蹄形，用水冲洗30分钟后备用；

S2：以月季的cDNA为模板,以RcCO特异引物RcCO-KpnI-F：GGGTACCTGAATCCGGTGAAGAACAGCAAC（SEQ ID No.2）和RcCO-XhoI-R：CCTCGAGACCTTCTCCATACTGAACTGGTAC（SEQ ID No.3）进行PCR扩增，得到RcCO干扰片段扩增产物（SEQ ID No.1）；用内切酶Kpn I和Xho I双酶切RcCO干扰片段扩增产物和质粒TRV2，得到RcCO干扰片段酶切产物和线性化的TRV2；通过T4DNA连接酶将RcCO干扰片段酶切产物插入到TRV2的多克隆位点，然后转化DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中摇菌过夜，再在含有相同抗生素的LB固体培养基上筛选阳性单克隆，用SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所述扩增引物做菌落PCR鉴定阳性克隆并测序，将测序正确后的连接质粒TRV2-RcCO转化农杆菌GV3101，在含有50mg/L卡那霉素和30mg/L利福平的LB液体培养基中摇菌后涂板，在含有相同抗生素的LB固体培养基上筛选阳性单克隆，用SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所述扩增引物做菌落PCR鉴定阳性克隆，得到含有植物表达载体TRV2-RcCO的农杆菌GV3101；

S3：采用冻融法将TRV1质粒转化农杆菌GV3101，用含有50mg/L卡那霉素和30mg/L利福平的LB固体培养基筛选，得到含有TRV1载体的农杆菌GV3101；将含有TRV1载体的农杆菌GV3101和S2得到的含有植物表达载体TRV2-RcCO的农杆菌GV3101分别在28°C振荡培养器以200rpm在含有50mg/L卡那霉素和30mg/L利福平的LB液体培养基中摇菌过夜至OD₆₀₀=0.5,然后将菌液转移到离心管中以5000rpm离心10分钟，沉淀用转化液重新悬浮，所述转化液为MS液体基本培养基，调整OD₆₀₀=0.4，将分别含有TRV1和TRV2-RcCO质粒的转化液以体积比1：1等比例混合，得到TRV 1/TRV 2-RcCO侵染液，备用；

S4：将S3制备得到的TRV 1/TRV 2-RcCO侵染液添加溴酚蓝指示剂，真空渗透法转化S1制备的茎段，至茎段全部变蓝为止；

S5：将S4侵染的茎段无菌水快速漂洗3次，按照马蹄形切口朝下的方向插入预先准备好的扦插基质中生根，所述扦插基质为蛭石:珍珠岩体积比5:1，基质穴盘上口封闭塑料盖保湿；在25°C，光照10000LUX，每天光照16小时、黑暗8小时的培养条件下培养3-4周后，将生根的茎段转移到生长基质，所述生长基质为蛭石:草炭土:珍珠岩=9:3:0.5，继续培养3-4周；

S6：以S5获得的转基因植株幼叶DNA为模板，以交叉引物F：TACGGACGAGTGGACTTAGATTCT（SEQ ID No.4）和R：ACCTTCTCCATACTGAACTGGTAC（SEQ ID No.5）对S5获得的转基因植株进行PCR筛选，筛选出具有清晰条带的样本确定为阳性转基因植株；阳性转基因植株幼叶提取RNA，反转录合成cDNA，设计RcCO特异引物RcCO-F：GATGGTTCAATTTCTCACACTGTT（SEQ IDNo.6）和RcCO-R：GGTTGGCATCTGAATTGTAGG（SEQ ID No.7）进行荧光定量PCR检测目的基因的表达量，对月季内源RcCO基因表达量降低50%以上的植株确定为干扰株系，观测干扰株系开花时间。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1所述月季为2年生月季品种月月粉；S4中真空渗透法为将烧杯放置到真空抽滤器中，将S1所得茎段平切口朝下倒置在烧杯中，使添加溴酚蓝指示剂的TRV 1/TRV 2-RcCO侵染液浸泡至茎段的1/3-1/2，0.5 MPa压力真空抽滤5-10分钟，至茎段基部马蹄形切口变蓝为止；或将S1所得茎段放置在50mL的医用注射器中，加入10-20mL侵染液，用手指封闭注射孔后反复抽拉手柄，至茎段的上下切口均变蓝为止。