[发明专利]一种用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能的方法。构建了烟草脆裂病毒TRV介导的RcCO基因病毒诱导基因沉默载体，并转化感受态农杆菌，继而通过真空渗透法对月季进行了瞬时转化，诱导了月季内源RcCO基因的沉默，实现病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能。该种方法简便易行、材料易得，采用TRV 1/TRV 2‑RcCO等比例混合的侵染液侵染月季，假阳性率低，表型鉴定周期短、转化效率高，便于高通量操作，为大规模开展月季基因功能研究提供依据。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能的方法。

背景技术

月季(学名：Rosa hybrid)，被称为花中皇后，蔷薇科。常绿，半常绿低矮灌木，四季开花，一般为红色，或粉色、偶有白色和黄色，可作为观赏植物，花成大型，由内向外，呈发散型，有浓郁香气，可广泛用于园艺栽培和切花。

月季是世界“四大切花”之首，但目前转基因体系还不成熟，严重阻碍了对其生长发育分子机制的深入研究，尤其是月季的开花过程，需要一定时间的营养积累期才能实现，表型鉴定周期较长。

目前，月季的转基因体系主要有稳定转化和瞬时转化两种方法。关于稳定转化方法申请公开和授权的相关专利主要有利用芽点(公开号CN103146748A)和体细胞胚(公开号CN102220372B)两种。利用茎段产生的芽点进行基因转化的缺点是增殖系数低，每个芽点需要刻伤，工序繁琐；利用体细胞胚进行转基因操作最大的缺点是体细胞胚的诱导困难、周期长，转化效率低。关于瞬时转化方法主要有申请者创建的“月季不定芽真空渗透转化法(Luet al,Plant Methods,2017,13:116)”，本方法的主要缺点的转基因的表达窗口期一般为3-7天，对于研究开花这样较长周期的生理过程，显得无能为力。

为了克服月季瞬时转化基因表达时间短的弊端，急需创建以病毒诱导的基因沉默体系为媒介、以带芽茎段为转化材料，结合扦插繁殖技术为一体的基因瞬时转化方法，以实现对开花基因的功能鉴定。

参考文献：

Jun Lu,Mengjuan Bai,Haoran Ren,Jinyi Liu,Changquan Wang.An efficienttransient expression system for gene function analysis in rose.Plant Methods,2017,13:116

发明内容

本发明的目的是提供一种利用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能的基因瞬时转化方法，该种方法简便易行、材料易得、表型鉴定周期短、转化效率高，便于高通量操作。

本发明的第一个目的是提供RcCO基因片段，包含以下(1)～(3)中任一所述的核苷酸序列：

(1)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列：

(CTGAATCCGGTGAAGAACAGCAACGGCAACCATAACAGTAACAACAATCCAAATAATAACAACAACGGTTTCTTCTTCGGAGTGGAGGTTGATGAGTACTTGGATTTTGTGGAGTACAACTCATCTGATCAGAACCAGCTCAGTACGACTACTGCTAGTACTGACCAGCATAACCAGTATGGTGTGCCGCACAAGATCAGTTATGGAGGTGATAGTGTTGTACCAGTTCAGTATGGAGAAGGT)；

(2)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的互补序列；

(3)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸所获得的核苷酸序列，且与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。