[发明专利]一种高效制备的重组Hispidalin抗菌肽及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种使用基因工程的方法，通过毕赤酵母诱导表达制备的Hispidalin抗菌肽及其应用。所述mHispidalin抗菌肽是将Hispidalin抗菌肽基因根据毕赤酵母表达系统偏好性进行密码子优化后，在N端依次插入EcoRI，起始密码子，6×His，以及“GATGACGATGACAAG”15个碱基，C端依次插入终止密码子，XhoI和KpnI酶切位点获得的，所得抗菌肽具有良好的温度稳定性、pH稳定性、相对蛋白酶稳定性，以及较低的溶血性，可广泛应用于抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、促进细胞愈合、免疫调节等领域。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种使用基因工程的方法，通过毕赤酵母诱导表达制备的Hispidalin抗菌肽及其应用。

背景技术：

抗菌肽因其分子量小、抗菌谱广、稳定好等特点，具有抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、促进细胞愈合、免疫调节等作用，在临床、医药、禽畜养殖、水产养殖和食品等行业都具有良好的应用前景。Hispidalin抗菌肽于2014年报道发现，来源于葫芦科药用冬瓜的种子，由49个氨基酸组成，分子量为5.7KDa，对细菌和真菌致病菌都有较好的抑制作用，天然抗菌肽Hispidalin具有良好的抗氧化性，清除自由基的能力，拥有较大的应用潜力。

然而生物体自身合成的抗菌肽总量太低，若依赖于天然提取来获得Hispidalin，工作量巨大，造价高昂，难以达到生产需求用量。通过基因工程方法获得抗菌肽产品，一方面廉价高效、满足研究需要，另一方面为实现抗菌肽工业化生产提供有效依据。

本发明是自从发现天然抗菌肽Hispidalin后首次通过基因工程的方法获得的高产量、高活性的重组抗菌肽Hispidalin，并且所用的表达细胞是通用低成本的真核生物——毕赤酵母。本发明采用巴斯德毕赤酵母表达系统，具有如下优点：(1)含有醇氧化酶启动子(AOX1)，可受甲醇的严格诱导调控，高效表达外源蛋白。(2)巴斯德毕赤酵母能够对表达的外源蛋白进行一系列的翻译后修饰，比如二硫键的形成，前体蛋白加工，糖基化修饰。(3)酵母自身分泌的蛋白少，表达的外源蛋白可以分泌在细胞内，也可以通过信号肽分泌至培养基或发酵液中，方便后续的分离与纯化。(4)易于生长，培养基价格低廉，可以高密度发酵获得产品，有利于实现工业化生产。(5)弥补了酿酒酵母表达菌株不稳定，表达质粒易丢失的缺点。

本发明将Hispidalin抗菌肽基因导入毕赤酵母GS115细胞中，以甲醇为唯一碳源进行诱导表达及后续亲和纯化，获得Hispidalin抗菌肽产品。且相关信息和产品在国内外未见公开报道，在国内外未见公开使用。

发明内容：

本发明的目的之一是提供一种重组Hispidalin抗菌肽，命名为mHispidalin抗菌肽，所述mHispidalin抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

本发明的另一目的是提供一种高效制备上述重组mHispidalin抗菌肽的方法。本方法对于载体的构建做了极大的改造，该尝试是在短时间(96h)内成功获得高表达高活性的重组抗菌肽mHispidalin的重要原因之一；将mHispidalin抗菌肽基因导入毕赤酵母细胞中，获得mHispidalin抗菌肽的表达菌株；以甲醇为唯一碳源对其进行诱导表达，取发酵液上清进行亲和纯化，获得mHispidalin抗菌肽产品。

具体制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建

将mHispidalin抗菌肽基因片段(SEQ ID NO:2所示)连接到pPICZαA表达载体上构建重组表达载体；