[发明专利]基于酶催化可控自组装生物条码检测HTLV-II DNA的方法

说明书

本发明提供一种基于末端脱氧核苷酸转移酶催化生物条码自组装对人T淋巴细胞白血病病毒II(HTLV‑II)DNA进行树突状放大检测的化学发光方法。该技术方案包括两个连续的反应步骤：(1)HTLV‑II DNA诱导的末端脱氧核苷酸转移酶催化的第一步酶促延伸与生物条码的树枝状自组装，和(2)末端脱氧核苷酸转移酶催化的第二步酶促延伸血红素存在下的化学发光检测。本发明中的技术方案检测下限可以达到0.5×10^‑18mol/L，灵敏度相比现有技术大大提高，特异性良好，操作简便。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化生物条码自组装对人T淋巴细胞白血病病毒II(HTLV-II)DNA进行树突状放大检测的化学发光方法。

背景技术

现有技术中，常用于检测核苷酸的技术手段，包括聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增反应(RCA)、环介导恒温扩增反应(LAMP)、杂交连锁反应(HCR)、催化发夹组装(CHA)扩增、连接酶链式反应(LCR)、核酸外切酶/核酸内切酶辅助的信号扩增反应(EASA)。PCR是一种基于热循环的DNA扩增技术，涉及严格的引物/模板设计和精确的热循环。RCA和LAMP是等温扩增技术，避免了PCR的繁琐热循环步骤。然而，RCA涉及复杂的环形模板的制备和分离步骤，而LAMP需要设计复杂的DNA发夹探针。另外，PCR、RCA和LAMP都依赖于DNA模板扩增，必然涉及到非特异性扩增，从而引发交叉污染。另外，HCR是基于两组DNA发夹探针之间的链式杂交反应，CHA扩增反应是根据目标物DNA催化两种DNA发夹探针之间的杂交而进行的反应。HCR和CHA扩增反应都是可以提供无酶参加的核酸信号放大反应，但是它们的反应需要精确设计DNA发夹探针。LCR利用热稳定性好的DNA连接酶连接相邻杂交的DNA探针，用于目标物DNA的检测。但是，LCR的反应条件包括合适的连接温度、循环次数和连接酶的浓度等，相对复杂，而且还需要凝胶电泳参与连接产物的分离。EASA使用核酸外切酶(例如核酸外切酶III和λ核酸外切酶)和核酸内切酶(例如切刻内切酶(Nt.AlwI和Nt.BbvCI)循环消化或者循环切割特定的核苷酸序列，使信号放大。但是，核酸外切酶III和λ核酸外切酶会诱导非特异性的消化，使该反应具有较差的灵敏度和特异性。

生物条码扩增技术(BCA)是一种新型的扩增技术，短寡核苷酸作为识别链和替代扩增单元，使信号放大。值得注意的是，在单个纳米颗粒上可以组装多个寡核苷酸链，随后的磁性分离为BCA提供了非常干净的反应环境，可以用来检测多种蛋白质和核苷酸，并且具有较高的灵敏度和特异性。然而，已有的报道的关于BCA中，纳米颗粒和靶标链是1：1的杂交比率，寡核苷酸/蛋白质修饰的纳米颗粒的制备过程复杂，区分信号探针与纳米粒子的程序也十分繁琐，目前，实现检测的高灵敏度和宽的动态范围仍然是一个巨大挑战，这就急需新的技术引入BCA中。

人类T淋巴细胞病毒是人类C型RNA肿瘤病毒家族中的一员，是一种致癌性RNA病毒，可分为HTLV-Ⅰ型、HTLV-Ⅱ型和HTLV-Ⅲ型，它与各种人类T细胞恶性肿瘤疾病和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)有着密切的联系。其中，HTLV-II与神经疾病、呼吸道疾病、炎症反应有很强的相关性。并且，感染HTLV-II的注射吸毒者可能通过继发性传播将病毒引入普通人群和献血者，从而诱发全球神经残疾和神经病变。考虑到HTLV家族成员的丰度低，体积小，序列同源性高以及它在生物医学研究中的关键作用，因此，开发一种高灵敏、高特异检测HTLV-II的有效方法是非常迫切的。

发明内容

本发明提供一种基于末端脱氧核苷酸转移酶催化生物条码自组装对人T淋巴细胞白血病病毒II(HTLV-II)DNA进行树突状放大检测的化学发光方法，该方法具有灵敏度高、易于操作的优点。为了实现以上技术目的，本发明提供以下技术方案：