[发明专利]一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法

权利要求书

1.一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，其特征在于，该方法包括：

(1)制备彩色二氧化硅纳米微球：在水溶液中加入二氧化硅纳米微球、有机染料和硅烷偶联剂，通过硅烷偶联剂将有机染料一步反应连接到二氧化硅纳米微球上，制得彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs；

(2)在体系中通过羧基乙基硅烷三醇钠盐将羧基修饰到彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs的表面，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modifiedcolored SiNPs；

(3)在羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNP表面进行抗体偶联：通过碳二亚胺化学法在羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modifiedcolored SiNP表面固定鼠抗E.coli O157:H7单克隆标记抗体mAb1，制备免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1；

(4)免疫层析试纸条的组装：试纸条由样品垫、释放垫、NC膜、吸水纸组成，将鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2喷涂于NC膜的检测线，将羊抗鼠IgG喷涂于质控线，将喷好的NC膜贴于PVC底板，依次将吸水纸、释放垫和样品垫组装至PVC底板，完成试纸条的组装；

(5)将待测样品和步骤(3)制备的免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1混合后滴至试纸条的加样孔，在检测线与mAb2形成三明治夹心结构，实现对大肠埃希氏菌O157:H7的快速检测。

2.根据权利要求1所述的一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：

取25mL烧杯，分别取10mL乙醇、815μL纯水、100μL氨水、200μLTEOS，形成体系于磁力搅拌状态下预水解30min；

取2.5mL浓度为1mg/mL的彩色二氧化硅纳米微球，倒入预水解好的体系中；反应12h后，直接在上述体系中加入25μL羧基乙基硅烷三醇钠盐25wt.％的水溶液(Carboxyethylsilanetriol sodium salt 25wt％in water，CES)，继续反应24h；

反应结束后，通过离心、乙醇和水洗涤数次，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNPs，保存于纯水中备用。

3.根据权利要求1所述的一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：

取羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球分散至1mL浓度为50mM、pH 6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES)中，离心洗涤1次后重悬至1mL MES；

称量1mg EDC和1.5mg NHS加入羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球的MES悬浮液，室温活化15min；

反应结束后用PB洗涤2次，重悬至1mL PB中，加入30μg鼠抗E.coli O157单克隆标记抗体mAb1，室温下摇床孵育2.5h；孵育结束后，离心并分散至含2％BSA的PB溶液中，放在4℃冰箱中孵育12小时，封闭未反应完的位点，离心后重悬至含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA的PBS中，4℃冰箱保存备用。