[发明专利]一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法

说明书

本发明公开了一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7(E.coli O157:H7)的免疫层析检测方法，以活性染料为染色剂制备彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs，在体系中通过羧基乙基硅烷三醇钠盐将羧基修饰到colored SiNPs表面，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl‑modified colored SiNPs；在carboxyl‑modified colored SiNPs表面固定鼠抗E.coli O157:H7的单克隆标记抗体mAb1制备免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs‑mAb1；将鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2包被至NC膜的检测线，羊抗鼠IgG包被至质控线；用预先混合致病菌样品和colored SiNPs‑mAb1的方法，将生成的复合物一起滴至试纸条的加样孔，在T线与mAb2形成三明治夹心结构，实现对E.coli O157:H7的快速检测。本发明方法具有良好的检测灵敏度和特异性，简单省时，过程环保经济，具有巨大的应用前景。

技术领域

本发明涉及免疫层析检测技术，尤其涉及一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法。

背景技术

大肠埃希氏菌O157H7(E.coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic escherichia coli,EHEC)的主要血清型，能够导致腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症和血栓形成的血小板减少性紫癜等病。该菌的流行暴发大多与食用被该菌污染的食物有关，其他污染途径还有饮用水和空气。从1982年发现E.coli O157:H7后，在世界各地陆续有中毒事件发生，对人类的健康造成威胁。因此，建立快速、简单、特异性强的检测方法对于E.coli O157:H7的防控具有重要意义。

根据GB/T 4789.36-2016，对E.coli O157:H7的检验方法主要有两种。国标法具有准确的检测结果，但其中的常规培养法和免疫磁珠捕获法其步骤都包括增菌、分离和检验，过程繁琐，耗时长。近年来，多种快速检测技术均有研究报道，如PCR技术、基因芯片技术、电化学免疫传感器、荧光免疫技术和ELISA等各有其优点和不足，研究更便捷的新型检测方法是发展趋势，比如免疫层析技术。

胶体金免疫层析技术现已广泛应用于多种检测领域，是一种适用于现场初筛的常用方法。在基于纳米材料的免疫层析技术中，信号放大，即降低检出限是关键技术环节，直接影响检测效果。因此，随着纳米材料制备技术的发展，免疫层析技术领域出现了乳胶颗粒、荧光二氧化硅微球、量子点、碳纳米材料、磁性微球、上转换纳米颗粒、脂质体和酶等纳米标记物，以及直接以荧光素作为标记物对E.coli O157:H7进行快速检测。荧光纳米材料需要特殊仪器，而脂质体和酶等信号标记物价格昂贵，这些缺陷限制了它们在快速检测中的广泛应用。目前为止，最常用的标记物仍然是AuNPs，但AuNPs易受酸碱、温度和盐浓度的影响，且颜色单一，限制了其在多重检测中的应用；此外，AuNPs颗粒与生物大分子的结合过程在液相中稳定性较差，容易出现聚集。因此，筛选出一种耐各种环境、颜色丰富，能用于多重检测的纳米标记物对于免疫层析技术的发展具有一定推动作用。

基于前期研究中用新方法合成得到的颜色丰富且鲜艳、稳定性和分散性好的彩色二氧化硅纳米微球(colored SiNPs)，尝试将其作为一类免疫层析纳米标记物，构建一种新型免疫层析双抗体夹心法检测技术，实现对食源性致病菌E.coli O157:H7的快速检测。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，该方法包括以下步骤：