[发明专利]一种FT mRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法

权利要求书

1.一种FT mRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据金坠梨中编码FT基因序列进行分析设计引物，分离和克隆鸭梨、杜梨中编码FT基因全长，利用生物信息学方法进行序列相似性分析，证实所得序列属于FT基因；

（2）分析鸭梨和杜梨的FT基因序列，寻找两者基因差异的位点，在此位点的上下游分别设计特异性引物，以构成酶切位点；

（3）鸭梨为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接以及鸭梨自体微嫁接、杜梨自体微嫁接；

（4）分别提取鸭梨自体嫁接、杜梨自体嫁接以及嫁接后砧木和接穗的总RNA，反转录成cDNA，用特异性引物进行巢 式第一轮PCR扩增得到各自FT基因片段；

（5）回收巢 式第一轮PCR扩增产物FT的基因片段，以此为模板，再使用一对长引物进行巢 式第二轮PCR扩增，再次得到各自的FT基因片段；

（6）用限制性内切酶对巢 式第二轮PCR回收产物进行酶切，比较同源嫁接和异源嫁接后的酶切谱图，如果在嫁接体系中存在mRNA的双向传递，则在接穗鸭梨的扩增产物酶切后会出现砧木杜梨特异性的条带，同样在砧木杜梨的扩增产物酶切后也会出现接穗鸭梨特异性的条带；如果存在mRNA的单向传递，则在接穗鸭梨的扩增产物酶切后会出现砧木杜梨特异性的条带或者在砧木杜梨的扩增产物酶切后会出现接穗鸭梨特异性的条带；如果mRNA不发生传递，那么扩增产物的酶切电泳图中就会显示出各自相应样品的条带而无其他杂带；

其中，用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因全长的引物为：

上游5’-ATGCCTCGGGACAGGGACC-3’

下游5’-TTATCTTCTCCTCCCACCGGAG-3’；

用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因片段的巢式第一轮引物为：

上游5’-GTTGTCCAGCAACCTAGAGTTGGTAC-3’

下游5’-TTATCTTCTCCTCCCACCGGAG-3’；

用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因片段的巢式第二轮引物为：

上游

5’-CAATGGTTGTGAGCTCAAACCTTCTCAAGTTGTCCAGCAACCTAGAG-3’

和下游

5’-AATCCAAGGTTATAAAGCTCGGCGAAGTCTCTGGTATTGAAGTTTTGG-3’；

所述的限制性内切酶为KpnІ；

用于提取总RNA的样品选择微嫁接30d后砧木杜梨茎段韧皮部和嫁接口以及接穗鸭梨茎段韧皮部。