[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法

权利要求书

1.一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，其特征在于：谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除aroE进行构建，具体步骤如下：

(1)敲除质粒构建：

以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，△aroE-1，△aroE-2为引物，通过PCR反应扩增427bp的敲除aroE的上游同源臂；以△aroE-3，△aroE-4为引物，通过PCR反应扩增559bp的下游同源臂；以△aroE-1，△aroE-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成1545bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化后与重叠片段同源重组，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△aroE；

(2)切割质粒构建：

通过CHOPCHOP设计aroE切割序列，从而设计切割所需crRNA序列：首先将质粒pXMJ19中的氯霉素抗性基因换成奇霉素抗性基因；然后用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19，纯化后与cpf1同源重组；提取质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI酶切，纯化后与crRNA同源重组，最终得到aroE切割质粒pXMJ19Cm^r∷spe^r-cpf1-crRNA-△aroE；

(3)敲除aroE目的菌株的获得：

将Corynebacterium glutamicum ATCC13032制成感受态细胞，将非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△aroE电转化到13032感受态细胞中，通过一次同源重组使非复制型质粒结合到谷氨酸棒杆菌基因组中，挑在卡那霉素抗性平板能正常生长的单菌落，以特异性鉴定引物△aroE-5，△aroE-6，△aroE-7，△aroE-8进行菌落PCR，条带大小正确的菌，接种于带有卡那霉素抗性的摇管里培养，得到13032△aroE单交换菌，将这个菌也制作成感受态，然后将切割质粒pXMJ19Cm^r∷spe^rcpf1crRNA-△aroE电转化到感受态细胞中，涂布于奇霉素抗性和链霉素抗性的平板，长出单菌落后以△aroE-1，△aroE-4为引物进行菌落PCR验证，条带正确的菌接摇管；经测序所得敲除菌株13032△aroE序列为序列表中序列23所示序列。

2.一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，其特征在于：谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除upp保护单交换不被切割的菌株，具体步骤如下：

(1)敲除质粒构建：

以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，△upp-1，△upp-2为引物，通过PCR反应扩增429bp的敲除upp的上游同源臂；以△upp-3，△upp-4为引物，通过PCR反应扩增458bp的下游同源臂；设计△upp-3时，在引物序列上加了一个碱基构建成NcoI酶切位点；同时△upp-3引物必须从PAM结构TTTN的后两个TN开始设计，保证前两个TT在敲除部分；然后以△upp-1，△upp-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成887bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化后与重叠片段同源重组，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△upp；

(2)切割质粒构建：

通过CHOPCHOP设计upp切割序列，从而设计切割所需crRNA序列；用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19，纯化后与cpf1同源重组；提取质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI酶切，纯化后与crRNA同源重组，最终得到upp切割质粒pXMJ19-cpf1crRNA-△upp；

(3)敲除upp单交换目的菌株的获得：

将Corynebacterium glutamicum ATCC13032制成感受态细胞，将非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△upp和切割质粒pXMJ19-cpf1-crRNA-△upp电转化到13032感受态细胞中，涂布到氯霉素和卡那霉素平板上；通过一次同源重组使非复制型质粒定向结合到谷氨酸棒杆菌基因组中；挑取单菌以uppjd-3，uppjd-4为引物进行菌落PCR验证。然后对正确条带的菌进行NcoI酶切验证；有NcoI酶切位点的菌即为目的菌株，该敲除upp单交换目的菌株具有序列表中序列24所示序列。