[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法

说明书

本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，包括基因敲除和多拷贝整合两方面：1.在敲除一些影响生长的基因时，首先利用pk18mobsacB质粒进行第一轮同源重组，然后利用CRISPR/Cpf1对基因组的双链切割作为筛选压力，选择正确发生第二次同源重组的菌株，保证了获得正确敲除菌株的效率；2.在进行基因多拷贝整合时，通过特殊同源序列设计原理，使得第一轮同源重组时pk18mobsacB插入到基因组上Cpf1作用位点，破坏PAM结构而导致CRISPR/Cpf1不对基因组发生切割作用，保证目标基因的特异性整合，如果整合到已有拷贝的序列或其他位点时，crRNA能够识别设计的切割序列从而引导Cpf1进行双链切断，导致菌株无法存活。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法。

背景技术

在微生物工业化生产中，希望得到尽可能高产量的产品。一种提高产量的方法是提高编码目的蛋白的基因的拷贝数量。这可以由将基因放于高拷贝数量质粒达到，但是如果在宿主细胞培养过程中没有选择性压力质粒是不稳定的且经常从宿主细胞中丢失。另一种提高目的基因拷贝数量的方法是将其以多拷贝整合入宿主基因组。同时，利用代谢工程构建生产菌株时，往往需要将一些副产物合成途径的基因敲除掉以加强目标产品合成的代谢流。总之，在基因组水平进行基因敲除和多拷贝关键基因的整合已经成为微生物分子育种的常规手段。

谷氨酸棒杆菌为为GRAS生物安全菌，在氨基酸发酵领域有着举足轻重的地位，至今已经被安全应用了近60年。目前，包括谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等大多数氨基酸都是利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产。近年来，随着基因工程手段引入谷氨酸棒杆菌菌种选育，构建出许多工程化谷氨酸棒杆菌菌株，其可利用的底物谱已得到极大的扩展，同时也可以生产出有机酸、醇类、二胺、萜类等化合物。目前，利用系统代谢工程构建谷氨酸棒杆菌高产菌株为工业微生物技术的核心领域之一。

然而，与大肠杆菌等模式菌种相比，谷氨酸棒杆菌为革兰氏阳性菌，基因编辑效率相对较低。现阶段常用的方法为非复制性质粒(如pk18mobsacB)介导的两次同源重组方法。最近，科学家们陆续报道了利用CRI SPR技术进行谷氨酸棒杆菌基因组编辑，然而，由于Cas9蛋白毒害性、谷氨酸棒杆菌同源重组效率低等问题，这些新技术直接用于基因组编辑还存在编辑效率低、重复性差等问题。但是，其双链切割对细胞致死效应是非常严谨的。另一方面，非复制性质粒介导的方法通过两次单独的同源重组，目标基因整合到基因组的几率大大提高，但是在多年应用过程中也发现一些问题，主要包括对一些影响生长的基因敲除效率极低(由于第二轮同源重组更倾向于回复打到出发状态)，和进行多拷贝整合时，会更加容易整合到已有基因的位点而导致难以获得特异性位点整合第一轮同源重组菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032敲除aroE进行构建，具体步骤如下：

(1)敲除质粒构建：

以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，△aroE-1，△aroE-2为引物，通过PCR反应扩增427bp的敲除aroE的上游同源臂；以△aroE-3，△aroE-4为引物，通过PCR反应扩增559bp的下游同源臂；以△aroE-1，△aroE-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成1545bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化后与重叠片段同源重组，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△aroE；

(2)切割质粒构建：