[发明专利]副溶血性弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.副溶血性弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针，其特征在于：包括VP捕获探针和VP检测探针，所述VP捕获探针的DNA序列为SEQ ID NO.1，所述VP检测探针的DNA序列为SEQ IDNO.2。

2.副溶血性弧菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：包括一块包被了polydT的96孔板、两瓶菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：

所述探针液瓶内由以下成分组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的6μmol/L的VP捕获探针12.5μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的6μmol/L的VP检测探针12.5μL；

合计25μL；

裂解液，体积为30μL，由所述菌液裂解液和裂解缓冲液混合配置而成；

所述杂交液，体积为100μL；

所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；

所述显色液，体积为150μL；

所述终止液，体积为100μL；

以上为一个微孔反应的用量。

3.根据权利要求2所述副溶血性弧菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液，管内为VP菌液，体积为5mL；所述阴性对照液，管内为非VP菌液，体积为5mL。

4.副溶血性弧菌夹心DNA杂交的分疾病检测目的的快速检测方法：包括如下步骤：

(1)增菌 用3％氯化钠碱性蛋白胨水培养待测菌48h，获得待测菌液；

(2)菌液裂解反应 将待测菌液和裂解液按体积比4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟；

(3)杂交反应 吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT的微孔中，按体积比4﹕1的比例混合核酸杂交液和探针液其中捕获探针和检测探针按以体积比1﹕1的比例混合，吸取125μL加到每一个微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育；温育后用1×PBST Buffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度；

(4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深待测菌浓度越高。