[发明专利]副溶血性弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种副溶血性弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法。该试剂盒根据靶序列设计2条探针(一条捕获探针和一条检测探针)，还包括一块包被了poly dT的96孔板、菌液裂解液、裂解缓冲液、杂交液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液。利用本试剂盒在2h内即可完成全部过程，通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果。本发明可以快速、大量、特异性地检测靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，可以凭肉眼判断结果，对操作人员没有技术上的要求，检测时间短。

技术领域

本发明具体涉及一种VP夹心DNA杂交技术快速检测用探针、试剂及其检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)广泛分布于近海岸的海水、海底泥沙、浮游生物和鱼、虾、贝类等海产品中。我国华东地区沿岸的海水的VP检出率为47.5％～66.5％，海产鱼虾的平均带菌率为45.6％～48.7％，夏季可高达90％以上。除了海产品以外，畜禽肉、咸菜、咸蛋、淡水鱼等都发现有VP的存在，已成为世界性公共卫生问题。生食或者食用未充分烹饪的被VP污染的海产品4～96h后可能会引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。极少情况下，副溶血性弧菌感染还会引起伤口感染、中耳炎及败血症等。健康人群感染副溶血性弧菌后症状较轻可自愈，但免疫功能受损的人群如肝炎、癌症及糖尿病患者，恢复期的肠道手术患者易感。据统计，1998年以来，在我国由副溶血性弧菌引发的食物中毒事件，发生规模及人群暴露规模呈明显上升的趋势，已位居沙门氏菌之上，成为我国细菌性食物中毒事故的首要病原。特别是沿海省份，副溶血性弧菌引起的食物中毒，已经高居微生物性食物中毒首位。所以亟需对食品中VP进行检测的方法，特别是在食品出入境的快速检测中。

VP为多形态革兰氏阴性细菌，无荚膜，无芽孢，形态呈球杆状、杆状、弧状、丝状，分散排列，大小不一，一般长度为0.7～1.0μm。VP的多形态性与盐的浓度不适宜有关，时有端生单毛，固体培养则常呈周身鞭毛。

VP营养要求不高，普通培养基、蛋白胨水中均可生长。在含盐3.5％的培养基上生长良好。发育温度为30～37℃，以37℃最佳，最适pH范围是7.0～9.5。该菌在普通平板上不溶血或只产生α-溶血，但在特定条件下，某些菌株在含高盐(7％)的人O型血或兔血及以D-甘露醇为碳源的我妻氏琼脂(Wagatsuma)平板上可产生β-溶血，称为神奈川现象(Kanagawaphenomenon，KP)阳性。神奈川现象阳性菌株与多数对人的致病性有密切关系切关系。

传统的副溶血性弧菌检测方法需要经过前增菌、增菌、选择性平板分离、生物化学试验和血清学分型鉴定4个步骤，整个过程通常需要5～7天，检测周期长，工作量大，不能满足水产品质量安全快速反应体系的需求，给水产品养殖、出入境检验检疫、食品卫生监督等部门的检测工作带来很大的困难。酶联免疫吸附(ELISA)试验检测副溶血弧菌具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但是ELISA对试剂的选择性要求过高、对结构类似的化合物存在一定程度的交叉反应，且出现新的血清型时，以现有的血清检测就会造成漏检。根据副溶血弧菌特异基因序列，设计引物进行PCR检测，是现阶段检测副溶血弧菌的最快速准确的方法之一。早期的副溶血弧菌的PCR法主要是检测编码毒力蛋白的致病基因tdh、trh。但是，这两种基因的携带率很低，随后被tlh基因取代。PCR技术操作简便，用时短，但是在操作过程中容易被DNA污染，且在灵敏度、多基因检测等方面有一定的局限性，不适合于用于副溶血弧菌的大规模筛选和培养检测。

目前国内外尚无利用夹心DNA杂交技术检测VP的试剂盒。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种副溶血性弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针，第二个目的是提供使用该探针的试剂盒，第三个目的是提供上述检测用探针的试剂盒的使用方法。