[发明专利]重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用

权利要求书

1.制备重组安克洛酶的方法，该重组安克洛酶是由N-末端和C-末端氨基酸残基分别为缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的234个氨基酸残基组成的一条具有如下序列的单链：

VIGGDECNIN EHRFLVAVYE GTNWTFICGG VLIHPEWVIT AEHCARRRMN

LVFGMHRKSE KFDDEQERYP KKRYFIRCNK TRTSWDEDIM LIRLNKPVNN

SEHIAPLSLP SNPPIVGSDC RVMGWGSINR RIDVLSDEPR CANINLHNFT

MCHGLFRKMP KKGRVLCAGD LRGRRDSCNS DSGGPLICNE ELHGIVARGP

NPCAQPNKPA LYTSIYDYRD WVNNVIAGNA TCSP；

该方法包括如下步骤：

(1)构建编码重组安克洛酶的基因表达载体和重组质粒：

构建用于在哺乳动物细胞中分泌性表达重组蛋白质的载体；

(2)重组安克洛酶在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达：

将含有安克洛酶蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达目的蛋白的细胞株；

(3)细胞培养生产重组安克洛酶：

将筛选到的稳定细胞株转入反应罐，用增补了氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖2mM、焦磷酸钾50μM的无血清培养基，在培养条件37˚C、5% CO₂、120rpm条件下培养至细胞密度不再增加，接着使培养温度由37˚C降至33˚C后继续培养至细胞密度不再增加后，收获培养物；所述无血清培养基的组成为：葡萄糖0.6%、谷氨酰胺2mM、3mM的NaHCO₃、5mM的Hepes、胰岛素2.5μg/ml、转铁蛋白100ng/ml、丁二胺60μM、硒酸钠30nM、青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、DF12加至100ml；

(4)重组安克洛酶的纯化：

(41)上层析柱前预处理：将上一步骤所得含有重组安克洛酶的培养液进行过滤去除细胞碎片，收集滤液，接着进行超滤浓缩，截留分子量30KDa膜板超滤至原体积的1/8~1/10；

(42)亲和层析柱：采用亲和层析柱即GE的Heparin Sepharose 6 Fast Flow进行纯化，使用盐浓度0.1~0.4mol/L的NaCl、0.05mol/L的Tris-HCl pH7.0~7.5缓冲液的洗脱条件，洗脱并收集活性组分；

(43)反相液相色谱纯化：采用制备型反相液相色谱技术，使用C4制备型色谱柱，纯化上述得到的重组安克洛酶蛋白，利用极性大小的差别，采用乙醇-水系统梯度洗脱的方法，进一步去除其他杂质；

(44)亲和柱层析：照步骤(42)的操作条件，将上一步骤收集的重组蛋白采用步骤(42)所述亲和层析柱纯化，去除乙醇并实现重组蛋白的浓缩。

2.根据权利要求1的方法，其中所述重组安克洛酶是一种平均分子量为39~41KDa的糖蛋白，包含的5个N-Link糖基化结合位点分别位于Asn²³-Trp²⁴-Thr²⁵，Asn⁷⁹-Lys⁸⁰-Thr⁸¹，Asn⁹⁹-Asn¹⁰⁰-Ser¹⁰¹，Asn¹⁴⁸-Phe¹⁴⁹-Thr¹⁵⁰和Asn²²⁹-Ala²³⁰-Thr²³¹处的天冬酰胺残基上，且该糖蛋白的等电点为4.5-5.5。

3.根据权利要求1的方法，其中所述重组安克洛酶是一种分子量分布范围为33~52KDa的糖蛋白。

4.根据权利要求1的方法，其中所述重组安克洛酶是一种修饰糖含量为19~49%的糖蛋白。