[发明专利]重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用

说明书

涉及重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用。具体地，该重组安克洛酶具有说明书所示氨基酸序列单链，该安克洛酶是平均分子量39～41KDa、分子量范围33～52KDa、修饰糖含量19％的糖蛋白。还涉及该重组安克洛酶的制备方法，细胞培养方法以及纯化方法和其治疗急性脑梗的应用。本发明重组安克洛酶呈现与天然安克洛酶显著更优异的性能。本发明方法能够以工业生产规格获得高表达量的重组安克洛酶，产量能够达到每毫升发酵液200IU/ml以上，比活性能够达到1000IU/mg。本发明重组安克洛酶具有更复杂和更完整的糖基化水平，稳定性显著增强，解决了安克洛酶表达量低、产业化困难的问题。

技术领域

本发明涉及一种重组安克洛酶、其制备方法及应用。更具体地，本发明涉及采用基因工程技术，利用哺乳动物CHO细胞培养生产方法制备重组蛋白，接着通过纯化工艺，可以容易的以工业生产规格获得高表达量的重组安克洛酶，产量能够达到每毫升发酵液200IU/ml以上，比活性能够达到1000IU/mg。本发明获得的重组安克洛酶具有更复杂和更完整的糖基化水平，稳定性显著增强，解决了现有该类产品表达量低、产业化困难的问题，本发明还涉及重组安克洛酶在治疗急性脑梗中的应用。

背景技术

安克洛酶(Ancrod)特指从马来西亚红口蝮蛇(Malayan pit viper，Calloselasmarhodostoma)蛇毒中分离纯化出的类凝血酶，为丝氨酸蛋白水解酶。能够水解哺乳动物的血浆纤维蛋白原，使之转变为纤维蛋白，从而影响动物的出血凝血过程。蛇毒类凝血酶特异性作用底物是纤维蛋白原，与凝血酶不同的是，它只切割纤维蛋白原的α链，而不作用于β链。当它水解血浆纤维蛋白原α链中的Arg¹⁶-GLy位键时，能够释放出纤维蛋白肽A，从而快速地将血液中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，由于蛇毒类凝血酶不激活凝血因子ⅩⅢ，这些生成的纤维蛋白单体不交联形成坚固的纤维蛋白网状结构，易于被体内的纤维蛋白水解酶所水解，因此可以抑制血栓形成，具有降低血粘度、抑制红细胞凝集、沉降、增强红细胞的血管通过性及变形能力、降低血管阻力以及改善微循环等作用。使溶栓作用快速，缺血部位功能恢复，从而达到治疗和防止复发的效果。

蛇毒类凝血酶制剂上市的品种有：来源于马来西亚红口蝮蛇蛇毒的安克洛酶(Ancrod，Viprinex，Arwin)；来源于巴西矛头蝮蛇(Bothrops moojeni)蛇毒的巴曲酶(Batroxobin)；来源于尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的降纤酶(Defibrase)。1985年至2000年，我国有不同蛇毒来源的含有蛇毒类凝血酶的多组分制剂流通，大多数称为蝮蛇抗栓酶。从1997年起，国产降纤酶替代了蝮蛇抗栓酶。

天然的蛇毒类凝血酶均为糖蛋白，糖基化水平的高低与比活性成正相关，与活性稳定性成正相关。

由于蝮蛇已经列入属国家二级濒危保护动物，天然蛇毒的资源极其有限，因此采用基因工程技术表达蛇毒类凝血酶具有现实意义。日本学者最早于1987年(J.Biol.Chem.262:3132-3135)将巴曲酶基因在大肠杆菌中表达成功，中国学者李招发等(中国专利授权公告号CN100564532C)在酵母菌中表达出生物活性高的巴曲酶蛋白，产量达到每毫升发酵液14巴曲酶单位(14BU/ml)，比活性为1400BU/mg。